Прижизненной микроскопии опухольассоциированных сосудистую использования передовых спинной складки окно камеры на трансгенные флуоресцентных мышей

Общая цель данного протокола заключается в использовании усовершенствованной дорсальной кожной камеры для детального изучения развития опухолевых сосудов на мышиной модели. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области онкологии, такие как совершенствование терапии и понимание механизмов прогрессирования опухоли. Основным преимуществом данной методики является возможность изучения процессов в соответствующем контексте, в условиях живого организма, а также возможность наблюдения за этими процессами в динамике.

Эту процедуру продемонстрирует доктор Энн Сейнхаве, старший научный сотрудник моей лаборатории. Из нетрансгенной мыши-донора возьмите фрагмент некротического опухолевого узла диаметром 10 mm для имплантации в дорсальную оконную камеру мыши-реципиента. В качестве донора используйте обычную мышь для сингенной опухоли или иммунодефицитную мышь для ксенотрансплантата.

Мышь-реципиент должна быть в возрасте не менее 12 недель и иметь массу тела 20 г и более. Все хирургические процедуры следует проводить в асептических условиях. Например, необходимо автоклавировать хирургические инструменты и материалы камеры.

После седации мыши-реципиента удалите шерсть со всей дорсальной стороны с помощью электрического триммера, затем используйте гель для депиляции. Промойте кожу и высушите ее. В завершение очистите депилированную кожу, протерев ее этанолом.

Теперь проведите горизонтальную центральную линию вдоль позвоночника. Затем расположите смотровое окно минимум на 2 mm ниже этой линии и обведите контур окна на коже. После этого с помощью скальпеля и ножниц осторожно удалите кожу внутри проведенного контура, не повреждая подлежащую фасцию.

Затем приподнимите кожную складку и с помощью пробойника для ушей сделайте отверстия диаметром 1 mm по обе стороны от области окна для болтов, которые будут удерживать окно на месте. Расположите заднюю рамку на мыши и зафиксируйте её, накрутив гайки на болты. Затем натяните кожу на два-три миллиметра поверх рамки, чтобы убедиться в плотности прилегания.

Если это так, проколите иглами 23G две отверстия для швов в верхней части рамы. Закрепите раму, затянув гайки, и зафиксируйте их зажимами для игл; не затягивайте гайки слишком сильно, чтобы предотвратить смещение кожи вокруг болтов. Затем замените иглы шовным материалом, чтобы закрепить раму на коже.

Теперь поверните мышь на бок. Под этим углом введите толстый кусочек заполняющего стекла и стандартное покровное стекло диаметром 12 миллиметров. Закрепите оба стекла фиксирующим кольцом так, чтобы фасция плотно прилегала к стеклу.

Следующим шагом является гидратация окна с использованием 0,9% sodium chloride. Позвольте нескольким каплям упасть на область обзора и промокните излишки. Теперь, непосредственно под окном, используйте иглу 25 gauge с изгибом 90 градусов, чтобы создать в фасции глубокий карман, способный вместить один кубический миллиметр опухолевой ткани.

Затем поместите ткань опухоли в карман. В завершение закройте смотровое окно с помощью стандартного покровного стекла диаметром 12 миллиметров и фиксирующего кольца. Любые пузырьки воздуха исчезнут в течение часа.

Перед седацией мыши разогрейте специально изготовленную платформу с контролем температуры до 37 °C. После седации поместите мышь на разогретую платформу. Установите носовой конус для подачи изофлурана, и, если оценка займет более пяти минут, нанесите офтальмологический гель для защиты глаз.

Теперь прикрепите камеру к специальному держателю с помощью болтов окна и зафиксируйте держатель на платформе. Затем очистите стеклянное окно водой и ваткой. Теперь, используя микроскоп, проверьте развитие сосудов в опухоли с помощью объектива 10-кратного увеличения при светлом поле и флуоресцентном освещении.

После общего осмотра включите лазеры конфокального микроскопа. На панели управления микроскопом установите следующие параметры: интеллектуальный усиление (smart gain) — 100 вольт за поворот, интеллектуальный смещение (smart offset) — 10% за поворот, среднее масштабирование (zoom), среднее позиционирование по осям X и Y, а также перемещение по оси Z — 100 микронов за поворот.

Установите режим сбора данных XYZ или XYZT. Выберите разрешение. Установите скорость сбора данных 2 или 400 Гц.

Установите диафрагму (pinhole) на один воздушный диск (airy unit). Выберите опцию двунаправленного сканирования по оси X. При анализе нескольких флуорофоров с возможным перекрытием спектральных диапазонов выберите последовательное сканирование между кадрами, чтобы предотвратить перетекание сигнала (bleedthrough), и настройте соответствующие пути луча.

Установите усреднение по строкам на значение четыре и, наконец, выберите новый набор данных для эксперимента. Теперь сфокусируйтесь на интересующей ткани; для этого рекомендуется использовать «сухие» объективы с большей числовой апертурой. Затем используйте режим быстрого сканирования в реальном времени (fast live scan), чтобы добиться максимально возможного соотношения сигнал/шум, отрегулировав усиление (gain) и смещение (offset) так, чтобы избежать пересветов.

Теперь выберите Z-стек на вкладке сбора данных (acquire). Выполните быстрое Z-сканирование. На основании полученного быстрого сканирования определите начальное и конечное положения для полного сканирования.

Затем установите размер шага по оси Z в соответствии с размером пинхола и выполните полное сканирование. Мыши-хозяева, экспрессирующие флуоресцентные метки, были подвергнуты визуализации после имплантации опухоли с использованием описанного протокола. Метка eNOStag-GFP экспрессируется в аппарате Гольджи и клеточной мембране эндотелиальных клеток.

Маркер ROSAmT/mG обеспечивает повсеместную экспрессию красной флуоресценции и экспрессию зеленой флуоресценции в клетках, экспрессирующих Cre-рекомбиназу. Одним из применений данной технологии является изучение развития сосудов, так как в опухолях наблюдаются все стадии этого процесса. Например, можно увидеть, как эндотелиальные фронты прорастают в неваскуляризированные области.

Опухоли также характеризуются наличием поврежденных сосудов и сформированных сосудистых сетей с развитыми разветвленными сосудами. Еще одним вариантом применения является изучение формирования просвета, кровотока и экстравазации путем введения меток в кровь, например, флуоресцентных наночастиц. Таким образом, можно наблюдать кровоток в просвете сосудистых трубок и вблизи эндотелиальных клеток-лидеров.

В клетках кончиков сосудов наблюдается формирование просвета. Интравитальная микроскопия также может быть использована для исследования эффекта химиотерапевтических средств. Например, через 24 часа после введения наночастиц животному линии eNOStag-GFP наночастицы оставались в сосудистом русле с минимальной экстравазацией в интерстиций опухоли.

Однако при совместном введении наночастиц и TNF наблюдалась экстравазация в интерстиций опухоли. Это свидетельствует о повышении доставки препарата в опухоль. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как устанавливать дорсальную камеру-окно в кожной складке и как изучать опухолевые процессы с помощью конфокальной микроскопии.