Прижизненной микроскопии опухольассоциированных сосудистую использования передовых спинной складки окно камеры на трансгенные флуоресцентных мышей

Общая цель этого протокола заключается в использовании усовершенствованной камеры дорсальной кожной складки для детального изучения развития опухолеассоциированной сосудистой сети на мышиной модели. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рака, такие как улучшение терапии и понимание прогрессирования опухоли. Основное преимущество этой методики заключается в том, что процессы изучаются в правильном контексте, в реальной жизни и что эти процессы можно изучать с течением времени.

Эту процедуру продемонстрирует доктор Энн Сейнхейв, старший научный сотрудник моей лаборатории. У нетрансгенной донорской мыши соберите некротический фрагмент опухоли диаметром 10 мм для имплантации в камеру дорсального окна мыши-реципиента. Используйте нормального донора мышей для сингенной опухоли или иммунодефицитного донора для ксенотрансплантата.

Мышь-реципиент должна быть не моложе 12 недель и весить двадцать или более граммов. Выполняйте все хирургические процедуры в асептических условиях. Например, автоклавировать хирургические инструменты и материалы камеры.

После введения седативных препаратов мыши-реципиента удалите волосы со всей спинной стороны с помощью электрического триммера, затем используйте гель для удаления волос. Промойте кожу начисто и высушите ее. Наконец, очистите депилированную кожу этанолом.

Теперь отметьте горизонтальную центральную линию вдоль корешка. Затем расположите окно просмотра на расстоянии не менее 2 мм ниже линии и отметьте периметр окна на коже. Далее с помощью скальпеля и ножниц аккуратно удалите кожу в пределах линии периметра, не повреждая нижележащую фасцию.

Затем потяните вверх обшивку и с помощью пробойника для ушей введите отверстия диаметром 1 мм по обе стороны от оконной области для болтов, удерживающих окно на месте. Расположите заднюю рамку на мыши и закрепите рамку, поместив гайки на болты. Далее натяните кожу на два-три миллиметра над рамой, чтобы убедиться, что она прилегает.

Если это так, проткните иглы 23 калибра через два отверстия для швов в верхней части рамы. Закрепите раму, затянув гайки, и удерживайте их с помощью зажимных иглодержателей, не затягивайте гайки слишком сильно и не допускайте обточки кожи вокруг болтов. Далее замените иглы на швы, чтобы закрепить каркас на коже.

Теперь поверните мышку в сторону. С этого угла вводят толстый кусок наполнителя стекла и стандартное 12-миллиметровое покровное стекло. Закрепите оба с помощью стопорного кольца так, чтобы приборная панель плотно прилегала к стеклу.

Следующим шагом является гидратация окна с использованием 0,9% хлорида натрия. Дайте нескольким каплям упасть на зону обзора и впитайте излишки. Теперь, прямо под окном, используйте иглу 25 калибра с изгибом 90 градусов, чтобы сделать глубокий карман в фасции, который может вместить кубический миллиметр опухолевой ткани.

Затем введите опухолевую ткань в карман. Наконец, закройте зону обзора окна с помощью стандартного 12-миллиметрового покровного стекла и стопорного кольца. Любые пузырьки воздуха рассеются в течение часа.

Перед усыплением мышь нагрейте изготовленную на заказ платформу с регулируемой температурой до 37 градусов по Цельсию. Успокоив мышь, расположите ее на прогретой платформе. Прикрепите носовой конус для введения изофлурана и, если оценка займет более пяти минут, назначьте офтальмологическое обследование.

Теперь прикрутите патронник с помощью болтов окна к изготовленному на заказ держателю и закрепите держатель на платформе. Затем очистите стеклянное окно водой и ватой. Теперь под микроскопом проверьте развитие сосудов в опухоли с помощью 10-кратного объектива под светлым и флуоресцентным светом.

После грубого осмотра включите конфокальные лазеры. Установите панель управления микроскопом на интеллектуальное усиление 100 вольт за оборот. Интеллектуальное смещение 10% за оборот, средний зум, среднее позиционирование по X и Y и 100 микрон Z-положения за оборот.

Установите режим сбора данных на XYZ или XYZT. Выберите разрешение. Выберите скорость сбора данных два или 400 Гц.

Установите отверстие на одну воздушную единицу. И выберите двунаправленный вариант X. При оценке нескольких флуорофоров с возможным перекрытием спектрального диапазона выберите последовательное сканирование между кадрами, чтобы предотвратить просвечивание, и установите правильные траектории луча.

Установите среднее значение строки равным четырем и, наконец, выберите новый набор данных для эксперимента. Теперь, сосредоточившись на интересующей вас ткани, лучше всего использовать сухие линзы с более высокой числовой апертурой. Затем используйте быстрое сканирование в реальном времени, чтобы получить наилучшее соотношение сигнал/шум, регулируя усиление и смещение таким образом, чтобы не было передержки.

Теперь выберите Z-стек на вкладке «Получить». Сделайте быстрое Z-сканирование. С помощью быстрого сканирования определите начальное и конечное положения полного сканирования.

Затем установите размер шага Z в соответствии с размером отверстия и перейдите к полному сканированию. Мыши-хозяева, экспрессирующие флуоресцентные метки, были визуализированы после имплантации опухоли с использованием описанного протокола. Метка eNOStag-GFP экспрессируется в Гольджи и клеточной мембране эндотелиальных клеток.

Метка ROSAmT/mG экспрессирует красное цветение повсеместно и зеленое цветение в клетках, экспрессирующих Cre Recombinase. Одним из применений этой технологии является изучение развития сосудов, поскольку в опухолях наблюдаются все стадии. Например, можно увидеть, как эндотелиальные фронты прорастают в неваскуляризированные области.

Опухоли также имеют поврежденные сосуды и установленные сосудистые русла со зрелыми разветвленными сосудами. Еще одно применение заключается в изучении формирования просвета, кровотока и экстравазации путем нанесения на кровь меток, таких как флуоресцирующие наночастицы. Таким образом, кровоток может наблюдаться в просвете сосудистых трубок и вблизи клеток эндотелиального верха.

В клетках кончика наблюдается формирование просвета подвоя. Прижизненная микроскопия также может быть использована для исследования действия химиотерапевтических средств. Например, через 24 часа после введения наночастиц животному eNOStag-GFP наночастицы оставались в сосудистой сети с минимальной экстравазацией в опухолевый интерстиций.

Однако при введении наночастиц в комбинации с TNF наблюдалась экстравазация в опухолевый интерстиций. Это свидетельствует об увеличении межопухолевой доставки лекарств. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как установить камеру с окном дорсальной складки кожи и как изучать процессы, связанные с опухолью, с помощью конфокальной микроскопии.