Загрузка кальциевой красителя в нервные окончания лягушек через нервный культи: регистрация переходного процесса кальция в нервно-мышечном соединении лягушки

Здравствуйте, меня зовут Дмитрий Самигуллин, я работаю в лаборатории биофизики синаптических процессов Казанского института биохимии и биофизики РАН. В нашей лаборатории мы изучаем обширные пути передачи сигналов кальция в нервно-мышечном соединении. Одним из наиболее доступных методов измерения синаптического уровня кальция является оптическая запись.

Здесь мы опишем метод загрузки чувствительного к кальцию красителя через нервную культю в нервные окончания лягушки. Кроме того, мы представляем протокол измерения и анализа обширного переходного процесса кальция в терминалах лягушек. С помощью этого метода можно изучить влияние активных лекарственных препаратов на пресинаптический уровень кальция во время синаптической активности.

Приготовление раствора для загрузки красителя. Кальциевый краситель Oregon Green BAPTA от Fluorescein выпускается в объеме 500 микролитров и содержит небольшое количество порошка в 500 микрограммах. Добавьте в порошок 14 микролитров раствора, содержащего HEPES.

Загрузите вихревой раствор и уменьшите вращение, чтобы тщательно перемешать. Оберните флакон с раствором для загрузки фольгой, во избежание попадания света. Храните загрузочный раствор при температуре минус 20 градусов Цельсия в морозильной камере.

Процедура загрузки красителя. Рассеките у животного кожную грудную мышцу. Поместите рассеченную ткань в серебряную чашку Петри.

Растяните ткань тонкими булавками из нержавеющей стали. Добавьте раствор Рингера в чашку Петри. С помощью лезвия бритвы отрежьте небольшой кусочек, примерно 2 миллиметра от десяти микролитров трубки для пипетки от тонкого конца.

Подготовьте кусочек пластилина для удержания пипетки для наполнения на чашке Петри. Соедините заправочную пипетку с помощью пластикового шприца через силиконовую трубку и переходники из трубок для пипетки. Удалите временный раствор Рингера из чашки Петри с помощью пластиковой пипетки.

Сухой препарат с помощью шприца. Это предотвратит всасывание раствора в разливочную пипетку. Достаньте флакон с загрузочным раствором из морозилки и дайте оттаять при комнатной температуре в темном месте.

Тонким пинцетом и ножницами, под визуальным контролем, с помощью стерильного микроскопа, разрежьте нерв близко к мышце. Оставьте около двух миллиметров культи нерва. Закрепите наполненную пипетку с помощью трубки и шприца, на чашке Петри с помощью пластилина.

Переместите его ближе к нервной ветви. Аккуратно аспирируйте культю нерва в наполненной пипетке. Извлеките всасывающую трубку из тупого конца дозатора.

Высушите культю нерва в начиночной пипетке с помощью шприца. Двигайтесь вверх по наполняющей пипетке вместе с культей нерва. Изолируйте культю нерва снаружи с помощью вазелина.

Еще раз высушите культю нерва в наполняющей пипетке шприцем. Наберите ноль целых пять десятых микролитров загрузочного раствора с помощью пипетки с длинным наконечником пипетки. Аккуратно вставьте наконечник пипетки с раствором для загрузки в заправочную пипетку.

Вытолкните смесь непосредственно в культю нерва. Запечатайте открытый конец дозатора вазелином. Добавьте небольшое количество раствора в чашку Петри.

Выдержать препарат при комнатной температуре в затемненном и влажном месте в течение пяти часов. После процедуры инкубации возьмите препарат, и извлеките наполнительную пипетку с загрузочным раствором. Поместите препарат в ванну и смойте его раствором Рингера.

Держите ванну с препаратом в течение ночи в холодильнике при температуре восемь градусов Цельсия. Подготовьте ткань к микроскопии. Возьмите препарат из ванны.

Смонтируйте препарат в камеру с серебряной подкладкой и слегка растяните ткань. Промойте салфетку свежим раствором Рингера. Возьмите с собой электрод для стимуляции аспирации.

Поместите стимулирующий всасывающий электрод в камеру так, чтобы его кончик находился близко к перерезанному концу нерва. Подтяните нерв к электроду. Конструкция электрода описана в статье Хазокоффа, ссылка на статью есть в материалах.

Закрепите подготовительную камеру на предметном столике микроскопа. Установите температурный щуп. Соедините впускные трубки в шнур питания для элемента Пельтье в камере подготовки.

Поместите отводящую трубку в камеру для приготовления. Включите перфузионный насос. Включите термин блок контроллера.

Установите температуру на блоке контроллера так, чтобы она достигала 20 градусов по Цельсию. Установите защитный экран от ультрафиолета. Настройте длительность задержки и период на стимуляторе.

Подсоедините провод от всасывающего электрода к стимулятору. Включите его. При объективе с малым увеличением проверьте мышечное сокращение, включив стимул.

Заполните систему перфузии раствором Рингера с низким содержанием кальция и высоким содержанием магния. Установите скорость перфузии около двух миллилитров в минуту. Замените объектив на 40-кратное увеличение.

Включите Polychrome V.Select Длина волны излучения и непрерывный режим подсветки. Откройте затвор. Объектив с 40-кратным увеличением, в флуоресцентном режиме подсветка обеспечивает нагрузку клемм.

Найдите терминал и сосредоточьтесь на нем. Нагруженные нервные и хорошо нагруженные двигательные нервные окончания представлены на рисунке. Видеосъемка с помощью ПЗС-камеры Red-Short Neuro CCD.

Запустите программное обеспечение Turbo-SM. Выберите, измените настройки. Входное количество кадров равно 500.

Введите название эксперимента. Базовая конфигурация — 1000 кадров в секунду. 80 на 80.

Выберите внешний триггер. Введите время предварительного срабатывания. Минус десять миллисекунд.

Введите количество повторов, 20. В программе Polychrome выберите режим внешней подсветки триггера. Запустите программу Clampex.

Протокол стимуляции нагрузки. Протокол доступен для скачивания на странице нашей лаборатории на сайте Казанского федерального университета. Перед записью сделайте темный кадр в программе Turbo-SM.

На тринокулярном кубе выбираем уровни обмена светового пути. 100 процентов для камеры. Запустите протокол стимуляции.

Выберите интересующий регион и проверьте сигнал. В ответ на стимуляцию нерва мы регистрируем изменение интенсивности флуоресценции, которое отражает поступление кальция в нервное окончание. Анализ данных.

В программном обеспечении Turbo-SM выберите файл. Затем выберите, уменьшите файлы. Выберите файлы.

Введите имя среднего файла и усредните их. Сохраните средний файл как файл fit. Выберите, сохраните как подходящий файл.

Введите имя файла и сохраните его. Запустите Image J и откройте инструменты ниже. Анализ, инструменты, ROI Manager.

Найдите сохраненный средний файл в формате fit. Перетащите его на изображение J.Увеличьте окно для лучшего просмотра. Выберите прямоугольную область интереса над тем, что вы считаете фоном.

Добавьте его в менеджер ROI. В менеджере ROI выберите, еще. Многомерность. Загрузка вниз означает.

Копирование данных, экспорт в Excel. В Excel используйте функцию усреднения для вычисления среднего значения фона для коэффициента. Не закрывая Excel, вернитесь к изображению J.Закройте окно с расчетом фона без сохранения.

Используйте Менеджер ROI, удалите прямоугольный фоновый рисунок. Откройте инструмент процесса, математика, вычитание. Введите рассчитанное среднее значение порога из Excel, и вычтите землю из стеков.

Выберите прямоугольную область интереса вокруг нервного окончания. Добавьте его в Менеджер по окупаемости инвестиций. В Менеджере ROI выберите, больше, Мультимера, Загрузка вниз, Среднее.

Скопируйте и вставьте в окно Excel. Используйте график инструмента Excel. Выберите плоскую область перед началом подачи сигнала.

Загрузите график с деталями от первых значений флуоресценции на остальных, до начала сигнала. Затем определите количество точек к средним значениям флуоресценции покоя. Усредните эти значения, затем найдите среднее число флуоресценции на остальных значениях.

Разделите сигналы на флуоресценцию на остальные. Вычтите один и умножьте на 100 процентов. Построение графика сигнала и расчет амплитуды кальциевого переходного процесса.

Временные параметры сигналов флуоресценции зависят от скорости прямых и/или обратных реакций образования кальциево-красителя-комплекса. Время нарастания кальциевого сигнала отражает динамику поступления кальция. Это диффузия в терминале и взаимодействие кальция с красителем.

Распад переходного процесса кальция зависит от сродства красителя и скорости буферизации кальция и его вывода. Анализ амплитуды переходных процессов кальция может быть использован для изучения влияния различных активных веществ на поступление кальция, которые участвуют в высвобождении нейромедиаторов. Эта техника нагрузки хорошо подходит для визуализации изменений цитосомного кальция.

С флуоресцентными индикаторами и как стимуляцией одного нерва, так и ритмической синаптической активностью. Анализ амплитуды переходных процессов кальция может быть использован для изучения влияния различных веществ на поступление кальция, участвующего в высвобождении нейромедиаторов. Есть несколько важных моментов, на которые мы хотим обратить внимание.

Процедура инкубации включает в себя два этапа. Выдерживают как при комнатной температуре, так и в холодильнике. Важно контролировать время инкубации с красителем при комнатной температуре.

В зависимости от длины культи нерва, красителя и температуры в помещении время инкубации может варьироваться. При чрезмерной обнажении предоперационные терминали и проксимальные отделы, расположенные близко к культе нерва, могут быть перегружены. Благодаря длительной инкубации в холодильнике, краситель равномерно распределяется по нервным окончаниям.

Важно поместить нерв в раствор для загрузки красителя в течение нескольких минут после разреза, чтобы позволить красителю проникнуть в нерв, так как более длительные промежутки времени вызывают неэффективную нагрузку, предположительно из-за получения закрытого нерва. Для уменьшения компартментализации красителя можно использовать удлиненную форму красителя. Очень важно не допускать длительного флуоресцентного освещения ткани, потому что это влияет на ее выживаемость.

Для поиска терминалов мы используем оптику Nomarski в канале видимого света. Во время записи мы ограничиваем освещенный обзор, диафрагмой. Длительность процесса заряжания может быть уменьшена с помощью затворного штампа нерва.

В этом случае можно использовать стеклянный микробайпас.