Производство и введения терапевтических мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (MSC) Spheroids грунтованный в 3-D культур Под Зенона свободных условиях

Общая цель данных экспериментов заключается в эффективном получении и введении терапевтических сферических агрегатов, или сфероидов, мезенхимальных стволовых/стромальных клеток (MSCs), подготовленных в условиях xeno-free для применения в экспериментальных и клинических целях. Эти методы позволяют преодолеть основные барьеры в области терапии MSCs, такие как низкая степень удержания, выживаемость и функциональность клеток. Последнее часто наблюдается после трансплантации диспергированных клеток и при воздействии неблагоприятных условий, обычно сопровождающих повреждение тканей.

Основным преимуществом данных процедур является то, что сфероиды МСК могут быть подготовлены, активированы и введены в отсутствие иммуногенных продуктов животного происхождения, таких как FBS, что в настоящее время ограничивает некоторые варианты клинического применения клеток и может затруднить интерпретацию некоторых доклинических данных. Хотя этот механизм потенциально очень полезен для обеспечения эффективности терапии на основе МСК, его также можно использовать для понимания опосредованного МСК восстановления тканей, а также того, как другие составы сред могут изменить терапевтический эффект. Эти процедуры продемонстрируют Джош Бивер и Брет Клоу, два техника из моей лаборатории.

После посева и инкубации мезенхимальных стволовых клеток согласно текстовому протоколу, соберите клетки, используя трипсин и EDTA. После центрифугирования собранных клеток при 450 ×g объедините все клетки в одной конической пробирке с соответствующей средой. Центрифугируйте клетки и ресуспендируйте осадок в небольшом объеме среды. Затем, после подсчета клеток, для создания сфероидов примерно из 25 000 клеток разведите собранные MSC в одной из следующих сред до концентрации 714 клеток на µL.

Затем нанесите капли клеток объемом 35 µL на внутреннюю сторону крышки инвертированной культуральной чашки диаметром 150 мм. Перенесите 20 мл PBS комнатной температуры в основание чашки и одним плавным непрерывным движением переверните крышку с каплями так, чтобы вершины капель были направлены вниз. Затем осторожно установите крышку на основание культуральной чашки.

Перенесите чашку в инкубатор на три дня, не беспокоя её, чтобы обеспечить надлежащую сборку сфер. После инкубации приступите к сбору сфероидов: осторожно снимите крышку и переверните её так, чтобы капли снова были направлены вверх. Затем наклоните крышку примерно на 10–20 градусов и с помощью клеточного лифтера переместите капли со сфероидами к краю планшета.

С помощью одномиллилитрового дозатора перенесите среду из лунки со сфероидами в коническую пробирку объемом 15 мл, затем промойте планшет комнатной температурой PBS тем же наконечником дозатора, чтобы обеспечить максимальный выход сфероидов. Для проведения ПЦР в реальном времени центрифугируйте суспензию сфероидов при 450 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем аспирируйте супернатант.

Промойте сфероиды с помощью PBS, после чего повторите этапы центрифугирования и аспирации. Для введения в животных дайте сферам осесть на дно пробирки без центрифугирования. Для сбора кондиционированной среды (CM) с целью анализа иммуномодулирующего и противоопухолевого потенциала, используя клеточный лифтер и пипетку, как было продемонстрировано ранее, перенесите сфероиды и среду CM в коническую пробирку объемом 15 мл.

Однако не промывайте крышки с помощью PBS. После центрифугирования при 450 ×g в течение 5–10 минут перенесите супернатант в пробирки объемом 1,5 мл. Центрифугируйте супернатант при 10 000 ×g и комнатной температуре в течение 5–10 минут.

Затем с помощью пипетки осторожно перенесите осветленную кондиционированную среду (CM) в новые пробирки объемом 1,5 мл для хранения при температуре -80 °C. После подготовки сфероидов, как было показано в этом видео, и выдерживания в течение трех-четырех минут до их оседания на дно пробирки, аспирируйте супернатант и промойте сфероиды, добавив HBSS с добавлением 0,2-0,5% HSA для поддержания условий отсутствия ксеногенных компонентов. Затем снова аспирируйте супернатант.

Покройте сфероиды 100–200 мкл стерильного HBSS/HSA и поместите пробирки на лед. После наркотизации мыши согласно текстовому протоколу поместите животное в бокс BSL-2 спиной вниз и продезинфицируйте нижнюю часть живота мыши 70% этанолом. Снимите колпачок с внутривенного катетера 20G и, удерживая кожу мыши одной рукой, найдите середину воображаемой линии, соединяющей согнутый коленный сустав и область гениталий; направив кончик иглы катетера к срединной линии, другой рукой выполните внутрибрюшинную инъекцию.

Осторожно извлеките металлическую стилетную иглу из узла катетера со стилетом. Проверьте стилет на наличие крови, мочи и фекалий, затем утилизируйте его. Подтвердите правильность установки пластикового катетера, вставив наконечник пипетки объемом 100–200 µL с 100 µL стерильного HBSS/HSA в адаптер шприца катетера, обеспечив плотное прилегание.

Затем медленно введите жидкость в брюшную полость. С помощью наконечника пипетки объемом 100–200 мкл соберите сфероиды MSA и раствор HBSS/HSA, после чего перенесите весь объем в брюшную полость через катетер, как было показано ранее. Далее промойте пробирку со сфероидами 100 мкл HBSS/HSA и перенесите весь объем полученной суспензии в брюшную полость.

Поместите марлевую салфетку, смоченную антисептиком, поверх катетера, затем медленно извлеките катетер из брюшной полости и утилизируйте его. Осмотрите катетер на наличие оставшихся сфероидов. После этого осторожно помассируйте брюшную полость пальцами, чтобы обеспечить равномерное распределение сфероидов.

Сразу после введения сфероидов мышам оцените уровень активации сфероидов, подготовленных для инъекций: перенесите от 40 до 120 сфероидов в катетере в лунки 12- или 6-луночного планшета, содержащего один-два миллилитра среды Alpha MEM с добавлением 2% FBS и 1X пенициллина-стрептомицина. Через шесть часов перенесите среду из лунок в пробирки объемом 1,5 или 15 миллилитров и центрифугируйте их при 450 ×g и комнатной температуре в течение пяти минут. Наконец, перенесите очищенную кондиционированную среду (CM) в новые пробирки объемом 1,5 миллилитра и используйте коммерческий набор ELISA в соответствии с текстовым протоколом для определения концентрации PGE-2.

Как видно здесь, при суспендировании примерно 25 000 MSC в каплях CCM объемом 35 µL клетки сначала собираются в небольшие агрегаты, но в конечном итоге, через 72 часа, сливаются в одну компактную сферу в верхней части капли. Этот рисунок демонстрирует, что для образования одиночных компактных сфер и XFM-1 требуется добавление HSA в концентрации 13 mg/mL, что соответствует расчетному общему содержанию белка в CCM. В процессе сборки сфер фенотип MSC радикально меняется, и при нахождении в соответствующей химически определенной безксеногенной среде усиливается экспрессия многочисленных противовоспалительных факторов, включая PGE2 и TSG6.

Однако продукция TSG6 и PGE2 не увеличивается значительно в MSC, культивируемых в виде сфер в XFM-2 или XFM-1 без HSA. Наконец, аналогично эффектам in vitro, сферы XFM-1 HSA, введенные в брюшную полость мышей сразу после индуцирования системного воспаления путем внутривенного введения LPS, повысили уровни PGE2 и IL-10 в брюшине, одновременно снижая уровень провоспалительного TNF alpha. После освоения метода подготовка каждого планшета с висячими каплями занимает от одной до двух минут.

При правильном выполнении внутрибрюшинное введение целых сфероидов может быть завершено за 5–10 минут на одно животное. При получении сфероидов из MSC методом «висячей капли» важно помнить, что различные составы ксено-свободных сред неодинаково влияют на формирование сфер и усиление экспрессии терапевтических генов. После выполнения данной процедуры можно использовать другие методы, такие как конфокальная микроскопия, чтобы изучить организацию MSC в сфероидах, а также определить возможные дополнительные сигнальные пути, активируемые в MSC в разных частях сфероида.

После этой разработки данный метод позволил ученым изучить другие условия 3D-культивирования и их влияние на прайминг MSC и экспрессию терапевтических генов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить прайминг MSC в виде сфероидов с помощью метода висячей капли, как оценивать их терапевтическую эффективность in vitro и как эффективно вводить целые сфероиды мышам для проверки эффективности in vivo. И не забывайте, что работа со стволовыми клетками взрослых людей требует специального оборудования и подготовки и может быть опасной при неправильном обращении с клетками.

При работе со стволовыми клетками взрослых людей необходимо постоянно использовать соответствующие средства индивидуальной защиты.