Количественное Бактериальный гистидинкиназа Автофосфорилирование Использование Nitrocellulose Анализ на связывание

Общая цель данного протокола заключается в количественном определении автофосфорилирования очищенных бактериальных гистидинкиназ. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области двухкомпонентных систем передачи сигнала, например, о влиянии когнатных стимулов при белок-белковых взаимодействиях на автофосфорилирование гистидинкиназ.

Основными преимуществами данной методики являются ее высокая пропускная способность, возможность точного определения пикомолей образованного фосфогистидина и получения кинетических параметров гистидинкиназ. В своей работе в качестве постдокторанта я использую фильтрацию через нитроцеллюлозные мембраны для количественного определения радиоактивных лигандов, связанных с белком. Следовательно, было целесообразно разработать аналогичный метод для количественного определения фосфорилирования гистидина в бактериальных гистидинкиназах.

Начните выполнение данной процедуры с подготовки реагентов и материалов, как описано в текстовом протоколе. Для подготовки устройства для дот-блоттинга на 96 лунок вырежьте фрагмент нитроцеллюлозной мембраны размером 8 см на 12 см. Поместите нитроцеллюлозу в устройство для дот-блоттинга.

Убедитесь, что мембрана прилегает плотно, аппарат герметизирован, а все лунки полностью закрыты мембраной. Для сбора фильтрата подсоедините аппарат ко вторичной колбе с боковым отводом. К штоку клапана подсоедините подходящий по длине шланг, чтобы аппаратом было удобно пользоваться, не опрокидывая вторичную колбу.

Затем подсоедините колбу вторичного бокового отвода к источнику вакуума (аспиратору). Проверьте герметичность установки, создав в ней вакуум. Если установка собрана правильно, во всех лунках будет поддерживаться сильный вакуум.

Все соединения трубок можно обернуть Parafilm или пищевой пленкой Saran для обеспечения герметичности. Перед началом работы приготовьте все четыре компонента реакции в виде 4X стоковых растворов, как описано в текстовом протоколе. Смешайте равные объемы реакционного буфера, гистидинкиназы и дважды дистиллированной воды.

Дайте компонентам реакции уравновеситься при комнатной температуре в течение короткого времени. Для запуска реакции добавьте один объем раствора ATP с γ-32 P и перемешайте, несколько раз пропустив жидкость через наконечник пипетки. Отсчитывайте время протекания реакции с помощью таймера и выдержите ее в течение требуемого времени.

Остановите реакцию. Добавьте аликвоту реакционной смеси в 325 мМ фосфорную кислоту. Немедленно поместите остановленные реакции на лед до тех пор, пока все реакции не будут прекращены.

Поместите предварительно собранное устройство для дот-блоттинга на 96 лунок во вторичный контейнер. Контейнер должен быть достаточно большим, чтобы в нем можно было легко разобрать устройство, так как после использования устройство и мембрана станут радиоактивными. Подайте вакуум на устройство для дот-блоттинга на 96 лунок.

После создания вакуума в аппарате осторожно перенесите закаленную реакционную смесь с помощью пипетки непосредственно на нитроцеллюлозную мембрану в каждую лунку. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока все реакции не будут нанесены на мембрану. Поскольку связывающая способность нитроцеллюлозы превышает количество нанесенной гистидинкиназы, можно считать, что при правильном нанесении почти вся киназа связывается с мембраной.

В зависимости от используемого оборудования, будьте осторожны, чтобы не проколоть нитроцеллюлозу. Убедитесь, что вся реакционная смесь вступила в контакт с нитроцеллюлозой. Часть смеси может легко остаться на стенках лунки.

Промойте лунки 100 µL ледяной 25 mM фосфорной кислоты. Это позволит любому объему реакционной смеси, который мог остаться в лунке, достичь мембраны, обеспечивая полное нанесение всех реакций. Дождитесь полного прохождения всего объема через мембрану.

Осторожно разберите установку перед отключением вакуума. Имейте в виду, что в данный момент как установка, так и нитроцеллюлозная мембрана являются радиоактивными. Не вынимайте компоненты установки из вторичного контейнера.

С помощью пинцета осторожно перенесите нитроцеллюлозную мембрану из аппарата в контейнер, содержащий примерно 200 миллилитров 25 миллимолярной ледяной фосфорной кислоты. Закройте контейнер крышкой, так как промывочный раствор будет радиоактивным. На данном этапе вакуумный насос можно выключить.

Поместите контейнер с промываемой мембраной на качалку. Оставьте мембрану для осторожного перемешивания в течение 20 минут. По истечении 20 минут аккуратно слейте использованный промывочный раствор в большой бак для временного хранения отходов.

Добавьте к мембране 200 миллилитров ледяной 25 миллимолярной фосфорной кислоты. Промойте мембрану таким образом не менее трех раз, чтобы удалить с нее фоновый сигнал γ-32 P ATP. После третьей промывки проверьте использованный промывочный раствор на наличие радиации с помощью счетчика Гейгера.

Продолжайте промывать мембрану до тех пор, пока в промывочном растворе не исчезнет сигнал. После достаточной промывки мембраны дайте ей ненадолго высохнуть на воздухе, что обычно занимает не более пяти минут. После экспозиции нитроцеллюлозы на фосфорном зеленом экране, как описано в текстовом протоколе, подготовьтесь к окрашиванию и обесцвечиванию Ponceau S.

Кратковременно погрузите нитроцеллюлозную мембрану в раствор красителя Ponceau S на одну-две минуты. Перед отмывкой убедитесь, что вся поверхность мембраны увлажнена красителем. Затем слейте излишки Ponceau S с мембраны.

Промывайте мембрану дважды дистиллированной водой до тех пор, пока не останутся окрашенными только пятна гистидинкиназы. Обратите внимание, что эта процедура сработает только в том случае, если все пятна содержат определяемое количество белка. С помощью ножниц вырежьте каждое пятно на нитроцеллюлозной мембране.

Необязательно вырезать строго по краю окрашенного пятна. Если мембрана была достаточно промыта, фон, вызванный разным размером вырезанных фрагментов, будет незначительным. Важно лишь полностью вырезать все пятно для каждой реакции.

С помощью пинцета осторожно перенесите каждое пятно в сцинтилляционные флаконы. Использование сцинтилляционного коктейля не требуется, так как фосфор 32 легко обнаруживается по излучению Черенкова. Затем нанесите несколько разведений раствора ATP, меченного gamma-32 P, на квадраты из нитроцеллюлозы размером 1 см на 1 см.

С помощью пинцета аккуратно перенесите каждый квадрат в сцинтилляционные флаконы без сцинтилляционного коктейля. Эти образцы будут использованы для построения стандартной кривой с целью определения количества импульсов в минуту на пикомоль раствора АТФ. Здесь показано окрашивание нитроцеллюлозной мембраны красителем Понсо.

Окрашивание во всех образцах равномерное, что свидетельствует об одинаковом количестве нанесенного материала. Результаты флуорографии нитроцеллюлозной мембраны показывают относительный уровень радиоактивно меченого фосфогистидина в каждом пятне. Четвертая и восьмая строки представляют собой отрицательные контроли, демонстрирующие вымывание избытка ATP из нитроцеллюлозной мембраны.

Здесь представлены репрезентативные результаты количественного определения автофосфорилирования гистидинкиназы. Эти данные получены методом сцинтилляционного подсчета для каждого пятна, вырезанного из мембраны. Представленная здесь калибровочная кривая количества импульсов в минуту на пикомоль ATP также получена с помощью сцинтилляционного подсчета и используется для расчета количества пикомолей фосфогистидина в каждом образце.

После выполнения данной процедуры в эксперимент можно включить другие методы, например, введение когнатных стимулов или белков, которые, согласно гипотезе, модулируют активность киназы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как влияние этих добавок на активность киназы. Не забывайте, что работа с радиоактивными веществами может быть чрезвычайно опасной. При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как прохождение надлежащего инструктажа по радиационной безопасности, использование средств индивидуальной защиты и экранирования.