Количественное Бактериальный гистидинкиназа Автофосфорилирование Использование Nitrocellulose Анализ на связывание

Общей целью данного протокола является количественная оценка аутофосфорилирования очищенных бактериальных гистидинкиназ. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области двухкомпонентной сигнализации. Например, влияние родственных стимулов в белок-белковых взаимодействиях на аутофосфорилирование гистидинкиназ.

Основные преимущества этого метода заключаются в том, что это высокопроизводительный метод, который может быть использован для точного обнаружения пикомолей образующегося фосфогистадина и получения кинетических параметров гистидинкиназ. Как постдокторант, я использую фильтрацию на мембранах нитроцеллюлозы для количественного определения связанных с белками радиоактивных лигандов. Следовательно, имело смысл разработать аналогичную методику для количественной оценки фосфорилирования гистидина в бактериальных гистидинкиназах.

Начните эту процедуру с подготовки реагентов и материалов, как описано в текстовом протоколе. Чтобы установить 96 лунок точечным аппаратом, отрежьте восьмисантиметровый на 12-сантиметровый кусок нитроцеллюлозной мембраны. Поместите нитроцеллюлозу в аппарат с точечной диаграммой.

Следите за тем, чтобы мембрана прилегала так, чтобы аппарат был герметизирован и все лунки были полностью закрыты мембраной. Чтобы собрать фильтрат, подключите аппарат к вспомогательной колбе для пистолета. Со штока клапана подсоедините подходящую трубку, чтобы обеспечить комфортное использование аппарата без опрокидывания вторичной колбы.

Затем подключите вспомогательную колбу пистолета к источнику вакуума аспиратора. Убедитесь, что аппарат полностью герметизирован, подав на него вакуум. Если аппарат правильно собран, то во всех лунках будет присутствовать сильный вакуум.

Все соединения трубок могут быть обернуты парапленкой или оберткой Saran для обеспечения герметичного уплотнения. Перед началом приготовьте все четыре компонента реакции в виде четырех исходных растворов X, как описано в текстовом протоколе. Смешайте равные объемы реакционного буфера, гистидинкиназы и дважды дистиллированной воды.

Дайте этим компонентам реакции ненадолго уравновеситься при комнатной температуре. Чтобы начать реакцию, добавьте один объем раствора гамма-32 P АТФ и перемешайте путем пипетирования вверх и вниз. Отслеживайте прошедшее время реакции с помощью таймера и позвольте реакции протекать в течение желаемого времени.

Погасите реакцию. Добавьте аликвоту реакции до 325 миллимолярной фосфорной кислоты. Немедленно поместите закаленные реакции на лед до тех пор, пока все реакции не прекратятся.

Поместите предварительно собранный 96-луночный аппарат для точечной диаграммы во вторичный контейнер. Этот контейнер должен быть достаточно большим, чтобы в нем можно было легко разобрать аппарат, так как аппарат и мембрана после использования будут радиоактивными. Подайте вакуум на 96 луночный аппарат точечной диаграммы.

Как только аппарат окажется под вакуумом, осторожно пипетируйте погасшую реакцию непосредственно на нитроцеллюлозную мембрану в каждой лунке. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все реакции не будут загружены на мембрану. Поскольку связывающая способность нитроцеллюлозы больше, чем количество пятнистой гистидинкиназы, можно предположить, что почти вся киназа связывается с мембраной при правильной нагрузке.

В зависимости от используемого аппарата, будьте осторожны, чтобы не проколоть нитроцеллюлозу. Обратите внимание, что вся реакция вступила в контакт с нитроцеллюлозой. Некоторой реакции легко прилипнуть к стенкам колодца.

Промойте лунки на 100 микролитров ледяной 25 миллимолярной фосфорной кислоты. Это позволит любому реакционному объему, который мог быть захвачен в лунке, достичь мембраны, обеспечивая полную загрузку всех реакций. Позвольте всему объему протекать через мембрану.

Осторожно разберите аппарат перед выключением пылесоса. Имейте в виду, что и аппарат, и нитроцеллюлозная мембрана в это время радиоактивны. Не извлекайте компоненты устройства из вторичного контейнера.

С помощью щипцов аккуратно перенесите нитроцеллюлозную мембрану из аппарата в емкость примерно на 200 миллилитров 25 миллимоляров ледяной фосфорной кислоты. Накройте эту емкость крышкой, так как смывка будет радиоактивной. В это время вакуум может быть отключен.

Поместите емкость с моющей мембраной на качалку. Дайте мембране мягко покачиваться в течение 20 минут. Через 20 минут осторожно сцедите использованный моющий раствор в большое ведро, которое будет использоваться для временного хранения отходов.

Добавьте в мембрану 200 миллилитров ледяной 25 миллимолярной фосфорной кислоты. Промойте мембрану таким образом не менее трех раз, чтобы удалить фоновый сигнал гамма-32 Р АТФ с мембраны. После третьей промывки проверьте использованный промывочный раствор на радиацию счетчиком Гейгера.

Продолжайте промывать мембрану до тех пор, пока в растворе для промывки не исчезнет сигнал. После того, как мембрана будет достаточно промыта, дайте мембране ненадолго высохнуть на воздухе, что обычно занимает пять минут или меньше. После воздействия на нитроцеллюлозу зеленого фосфора, как описано в текстовом протоколе, приготовьтесь к окрашиванию и задержанию Ponceau S.

Кратковременно погрузите нитроцеллюлозную мембрану в окрашивающий раствор Ponceau S на одну-две минуты. Перед тем, как удалить пятно, намочите всю мембрану. Затем сцедите излишки Ponceau S с мембраны.

Промойте мембрану двойной дистиллированной водой до тех пор, пока не окрасятся только пятна от гистидинкиназы. Обратите внимание, что эта процедура будет работать только в том случае, если все пятна содержат обнаруживаемое количество белка. С помощью ножниц вырежьте каждое пятнышко на нитроцеллюлозной мембране.

Не стоит идеально резать по краю испачканного пятна. Если мембрана была достаточно промыта, фон из-за разного размера пятен выреза незначителен. Важно только вырезать все пятно для каждой реакции.

С помощью щипцов аккуратно переложите каждое пятнышко в сцинтилляционные флаконы. Сцинтилляционный коктейль не требуется, так как фосфор-32 легко обнаруживается черенковским излучением. Затем определите несколько разведений раствора АТФ гамма-32 на квадратах нитроцеллюлозы размером один сантиметр на один сантиметр.

С помощью щипцов аккуратно переложите каждый квадрат в сцинтилляционные флаконы без сцинтилляционного коктейля. Эти образцы будут использоваться для построения стандартной кривой для определения количества отсчетов в минуту на пикомоль раствора АТФ. Здесь показано окрашивание нитроцеллюлозной мембраны по методу Понсо.

Окрашивание равномерно по всем образцам, что указывает на то, что все образцы одинаково загружены. Результаты флюорографии нитроцеллюлозной мембраны показывают относительный уровень радиоактивно меченого фосфогистидина в каждом пятне. Четвертый и восьмой ряд являются отрицательными контрольными, демонстрирующими, что избыток АТФ вымывается из нитроцеллюлозной мембраны.

Представлены репрезентативные результаты количественного определения аутофосфорилирования гистидинкиназы. Эти данные генерируются в результате сцинтилляционного подсчета каждого места, вырезанного из мембраны. Показанная здесь стандартная кривая подсчета количества фосфогистидина в минуту также получена на основе сцинтилляционного подсчета и используется для расчета пикомолев фосфогистидина, присутствующих в каждом образце.

После этой процедуры в эксперимент могут быть добавлены другие методы, такие как введение родственных стимулов или белков, которые, как предполагается, модулируют активность киназы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как влияние этих добавок на активность киназы. Не забывайте, что работа с радиоактивностью может быть чрезвычайно опасной. При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как надлежащий инструктаж по радиационной безопасности и использование средств индивидуальной защиты и экранирования.