Дикого типа Блокирование ПЦР в сочетании с прямым секвенированием как высоко чувствительный метод обнаружения низкочастотных соматические мутации

Общая цель этой процедуры заключается в обнаружении низкочастотных соматических мутаций в различных типах образцов. Эта методология может помочь ответить на ключевые вопросы в тестировании соматических мутаций, облегчая обнаружение мутаций очень низкой частоты. Здесь мы будем искать мутации в гене myd88 в образцах костного мозга.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она предоставляет высокоточную и чувствительную информацию о наличии соматических мутаций даже при очень небольшом количестве опухолевых клеток. Этот анализ секвенирования на основе ПЦР с блокированием дикого типа был разработан для амплификации части пятого экзона в гене myd88, обеспечивая охват горячей точки L265. Прямые и обратные капсюли были спроектированы с использованием последовательности M13 с пятью простыми числами, что позволяет использовать дополнительные капсюли для секвенирования.

Спроектируйте блокирующий олигонуклеотид так, чтобы он имел длину примерно от 10 до 15 оснований и дополнял шаблон дикого типа, в котором желательно обогащение мутантами. Более короткий олиго улучшит распознавание несоответствия. Для достижения высокой специфичности мишени важно не использовать слишком много блокирующих нуклеотидов, так как это приведет к образованию очень липких олигонуклеотидов.

Чтобы спроектировать блокирующий олигонуклеотид, начните с перехода на веб-сайт Oligo Tools. Выберите средство прогнозирования Oligo TM. Откроется новое окно.

Вставьте последовательность шаблона типа wild, который нужно заблокировать, в поле последовательности oligo. Добавьте знак плюс перед основаниями блокираторов, чтобы отметить их. Нажмите на кнопку расчета, чтобы определить примерную ТМ гибрида-блокатора ДНК.

Рассчитанные температуры плавления появятся в полях ниже. Спроектируйте блокирующий олиго так, чтобы температура плавления была на 10–15 градусов Цельсия выше температуры растяжения во время термоциклирования. Здесь температура распространения составляет 72 градуса по Цельсию.

Чтобы отрегулировать температуру плавления, добавляйте, удаляйте или заменяйте блокирующие основания. Избегайте длинных отрезков из трех-четырех блокирующих баз C или G. Затем, чтобы избежать образования вторичной структуры или самодимеризации, вернитесь на главный экран веб-сайта Oligo Tools и выберите инструмент Oligo Optimizer.

Откроется новое окно. Вставьте в поле последовательность шаблона типа wild, который нужно заблокировать. Добавьте знак плюс, обозначающий блокирующие базы.

Выберите два поля для вторичной структуры и только для себя и нажмите кнопку анализа, чтобы увидеть оценки для гибридизации и вторичной структуры. Эти оценки представляют собой очень грубые оценки температур плавления собственных димеров и вторичных структур соответственно. Более низкие баллы являются оптимальными и могут быть достигнуты путем ограничения пары блокирующих блокаторов.

Удалите или переместите блокирующие нуклеотиды для достижения более низких показателей. Показанный здесь оптимизированный блокирующий олигонуклеотид для myd88 обеспечивает баланс между температурой плавления гибрида блокатора ДНК и достаточно низкими показателями гибридизации и вторичной структуры. Он был разработан для покрытия аминокислот от Q262 до I266 и имеет три основных инвертированных DT для ингибирования как удлинения ДНК-полимеразой, так и деградации тремя первичными экзонуклеазами.

После того, как праймеры сконструированы, настройте блокирующий ПЦР дикого типа и выполните термоциклирование, как описано в сопроводительном документе. Достаньте магнитные шарики из хранилища при температуре четыре градуса Цельсия и доведите их до комнатной температуры. Перенесите 10 микролитров продукта ПЦР на новую ПЦР-планшет.

магнитные шарики, чтобы полностью суспендировать магнитные частицы, а затем добавьте по 18 микролитров магнитных шариков в каждую лунку на новой пластине. Перемешайте пипеткой вверх и вниз 10 раз. Затем выдержите тарелку при комнатной температуре в течение пяти минут.

После инкубации поместите ПЦР-планшет на магнитную пластину с боковой юбкой на две минуты, чтобы отделить шарики от раствора. Используйте многоканальную пипетку для аспирации надосадочной жидкости. Следите за тем, чтобы шарики не попадали в гранулы.

Затем выдайте по 150 микролитров 70% этанола в каждую лунку и инкубируйте планшет при комнатной температуре не менее 30 секунд. Затем отсадите этанол с помощью многоканальной пипетки и выбросьте кончики. Повторите эту процедуру стирки еще раз.

С помощью многоканальной пипетки объемом 20 микролитров отсадите оставшийся этанол из каждой лунки и выбросьте наконечники. Подождая около 10 минут, чтобы лунки планшета высохли, снимите его с магнита и добавьте в каждую лунку по 40 микролитров воды, не содержащей нуклеазы. Перемешайте пипеткой вверх и вниз 15 раз.

Затем выдерживают при комнатной температуре в течение двух минут. После инкубации поместите ПЦР-планшет обратно на магнитную пластину на одну минуту, чтобы отделить шарики от раствора. Перенесите 35 микролитров очищенного продукта на новую ПЦР-планшет и выполните двунаправленное секвенирование, как описано в сопроводительном документе.

После проведения двунаправленного секвенирования для очистки продуктов секвенирования готовят свежий один в 25 растворе трех моляров ацетата натрия с PH 5,2 и 100% этанол. Также приготовьте свежий раствор из 70% этанола. В каждую лунку планшетов как прямой, так и обратной последовательности добавьте 30 микролитров ацетата натрия в 100% этаноле и пипеткой вверх и вниз пять раз перемешайте.

Затем снова запечатайте пластину, и выдерживайте в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут. По прошествии 20 минут центрифугируйте планшет при 2, 250 G в течение 15 минут. После отжима снимите герметик для пластин и переверните пластину один раз над контейнером для отходов.

Если пластину перевернуть несколько раз, пеллеты могут отсоединиться от дна скважины. Положите перевернутую пластину на чистое бумажное полотенце и центрифугируйте при 150-кратном G в течение одной минуты. Затем добавьте по 150 микролитров 70% этанола в каждую лунку и снова закройте пластину.

Вращайте со скоростью 2, 250 раз G в течение пяти минут. Затем повторите процесс снятия запайщика пластин и переворачивания пластины. Если лунки не полностью высохли, дайте им высохнуть на воздухе при комнатной температуре.

Убедитесь, что образцы защищены от света. Как только лунки полностью высохнут, добавьте по 10 микролитров формамида в каждую лунку и пипеткой вверх и вниз 10 раз перемешайте. Снова запечатайте пластину.

Денатурируйте с помощью термоамплификатора при температуре 95 градусов Цельсия в течение трех минут, а затем при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. После денатурации замените пломбировщик пластины на септу и выполните секвенирование на платформе секвенирования в соответствии с инструкциями производителя. Используя программное обеспечение для анализа последовательностей, визуализируйте трассы и выровняйте последовательности по соответствующим опорным последовательностям.

Выровняйте myd88 по эталонной последовательности NCBI NM002468. Геномная ДНК пациентов с мутациями и без них подвергалась ПЦР с блокированием как обычного, так и дикого типа, а полученные продукты ПЦР затем секвенировались. Как видно на рисунке, мутантный аллель был обогащен при проведении ПЦР, блокирующей дикий тип, и в ДНК дикого типа ложноположительные результаты не наблюдались.

Характерное снижение интенсивности сигнала, как показано здесь, часто наблюдается, если используется слишком высокая концентрация блокатора или если после очистки ПЦР не удалось удалить блокатор до двунаправленного секвенирования. Это происходит, когда ферментативная очистка проводится вместо магнитной очистки шариками. Любой анализ, основанный на ПЦР, который обогащает мутантные аллели, обнаружит низкочастотные артефакты.

Эти следы показывают увеличение артефактов секвенирования CG по сравнению с артефактами TA в ткани FFPE, когда цитозин или метилированный цитозин дезаминируются путем формальной инфиксации с урацилом или тиамином соответственно. ДНК-гликозилаза урацила или UDG может исключать урацил до ПЦР, блокирующей дикий тип, что помогает уменьшить артефакты секвенирования. Тем не менее, тиамин, получаемый из дезаминированных пяти метилцитозина, который часто встречается на островах CPG, не может быть удален UDG.

Снижение концентрации блокатора, используемого в ПЦР с блокированием дикого типа, может помочь уменьшить возникновение артефактов секвенирования, которые не устраняются лечением UDG. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как тестировать соматические мутации с высокой степенью точности и чувствительности, используя технику блокировки дикого типа. Принцип этой технологии может быть применен для обнаружения мутаций в небольших субпопуляциях клеток.

Таким образом, он полезен для выявления минимальной остаточной болезни, наблюдения за пациентами и прогнозирования раннего рецидива у пациентов с различными новообразованиями.