Масштабные реконструкций и независимой, беспристрастной кластеризация на основе морфологических показателей для Классифицировать Нейроны в селекционных популяциях

Целями данного протокола являются описание этапов реконструкции морфологии нейронов, маркированных вирусом, и проведение независимого несмещенного кластерного анализа популяций маркированных нейронов для обеспечения комплексной характеристики морфологических показателей различных подклассов нейронов. Мы описываем новый подход к сбору и анализу нейроанатомических данных для обеспечения более полного отбора проб и несмещенной классификации морфологически уникальных типов нейронов внутри селективной популяции нейронов. Основным преимуществом данного метода является возможность проведения крупномасштабного анализа морфологии нейронов с использованием несмещенных методов классификации различных подклассов нейронов.

Наиболее сложными аспектами морфологической реконструкции являются выбор достаточно изолированных нейронов для восстановления, назначение правильной глубины по оси z и совмещение дендритных и аксональных деревьев для продолжения реконструкции на соседних срезах ткани. Начните реконструкцию с выбора предметного стекла с окрашенным срезом ткани мозга примата толщиной 50 мкм, которому стереотаксически ввели модифицированный вирус бешенства, экспрессирующий EGFP. Поместите стекло в держатель для предметных стекол и сфокусируйтесь на интересующем срезе, используя объектив с малым увеличением.

Убедитесь, что изображение с камеры отображается в режиме реального времени, правильно отрегулировав затвор камеры. Выберите достаточно изолированный меченый нейрон в интересующей структуре мозга, чтобы обеспечить однозначную реконструкцию дендритного дерева. Переключите увеличение на 10x и наведите фокус на выбранную область.

При выборе нейронов отдавайте предпочтение тем, тело которых полностью находится в пределах одного среза, чтобы точно оценить его площадь и округлость. После выбора хорошо окрашенного и изолированного нейрона нажмите кнопку нового среза в программном обеспечении, чтобы добавить основной срез, содержащий тело клетки, в менеджер срезов. Введите количество срезов, которые необходимо включить в реконструкцию.

Рекомендуется начать с установки двух-трех срезов. Установите толщину среза 50 microns. Выберите объектив 2x, затем нажмите кнопку контура (contour) на верхней панели инструментов и выберите тип контура из выпадающего меню.

Обведите контур целевой структуры, кликая мышью по точкам вдоль этого контура. По завершении обводки нажмите правую кнопку мыши и выберите в меню пункт «close contour» (закрыть контур), чтобы замкнуть линию. Затем, сохраняя двукратное увеличение изображения, выберите нужный символ маркера на левой панели инструментов.

Затем нажмите на центр целевой структуры, чтобы установить маркер. После завершения построения контуров выберите объектив 40x или 60x, чтобы обвести контур тела клетки. Затем нажмите кнопку трассировки нейронов на верхней панели инструментов и выберите в выпадающем меню структуру нейрона, которую необходимо отрисовать, в данном случае — тело клетки.

Обведите тело клетки, кликая по точкам вдоль его наибольшей протяженности, при необходимости регулируя глубину по оси z, чтобы привести тело клетки в фокус. Нажмите правую кнопку мыши, чтобы завершить контур тела клетки. Затем установите маркер другого стиля в центре контура тела клетки, убедившись, что маркер расположен примерно по центру по глубине z.

Перед началом каждого трассирования крайне важно установить правильную глубину по оси z как в основном разделе, так и в соседних разделах, чтобы значения оси z были точными. Чтобы начать трассирование дендритных деревьев, выберите «dendrite» в верхнем выпадающем меню.

Затем обведите каждый дендрит, начиная от тела клетки. Когда дендрит разветвляется, щелкните правой кнопкой мыши и выберите «bifurcating node» (бифуркационный узел) или «trifurcating node» (трифуркационный узел), чтобы установить узел в точке ветвления. Обязательно регулируйте глубину по оси z в процессе обводки, чтобы точно зафиксировать угол и направление дендрита.

В конце дендрита в данном срезе щелкните правой кнопкой мыши и выберите пункт ending («конец») в выпадающем меню. После того как все дендритные деревья в основном срезе будут отрисованы, определите те окончания дендритов, которые, вероятно, продолжаются в следующем прилегающем срезе. Сопоставьте их с соответствующей глубиной по оси z на микрофотографии при увеличении 20x.

Включите в микроскопическое изображение основные близлежащие ориентиры, такие как кровеносные сосуды или легко узнаваемые паттерны или пучки дендритов. Затем сделайте снимок живого изображения с помощью цифровой камеры, удерживаемой в руке перед экраном компьютера. После этого переключите объектив микроскопа на 2x и перейдите к соседнему срезу на предметном стекле.

Затем совместите контуры ранее отрисованного среза в окне программы с границами LGN и TRN на новом срезе. Вернитесь к 20-кратному увеличению и проведите выравнивание по ориентирам. Затем, используя фотографию окончаний дендритов с предыдущего отрисованного среза, переместите отрисовку для выравнивания дендритов, предварительно выбрав реконструкцию с помощью инструмента «стрелка».

Затем щелкните правой кнопкой мыши, выберите в выпадающем меню пункт «move» (переместить) и переместите трассировку соответствующим образом. Чтобы повернуть трассировку, щелкните правой кнопкой мыши, выберите в выпадающем меню пункт «rotate» (повернуть) и поверните трассировку соответствующим образом. В качестве альтернативы выберите инструмент «match» (совмещение) в верхнем выпадающем меню инструментов и укажите количество точек для совмещения.

Затем нажмите на окончание в реконструкции и на соответствующую точку продолжения на живом изображении, чтобы сопоставить окончания дендритов с их началами. Как только трассировка из предыдущего среза будет выровнена с дендритами в новом срезе, добавьте новый срез в менеджер срезов, как и прежде. В качестве альтернативы можно просто выбрать соседний срез, созданный ранее, и отрегулировать глубину по оси z таким же образом.

Убедитесь, что в менеджере разделов выбран соответствующий новый раздел, нажав на текущий раздел. Затем, увеличив увеличение до 40x или 60x, выберите дендрит с помощью стрелки. Щелкните правой кнопкой мыши по концу дендрита из предыдущего раздела и выберите «add to ending» (добавить к концу) в выпадающем меню.

В появившемся окне появится запрос о том, находится ли продолжение в новом разделе. Нажмите «да». Затем проследите продолжение дендрита, используя мышь в качестве инструмента рисования.

Сделайте снимки окончаний в preparation к совмещению со следующим срезом. Затем продолжайте трассировку дендритов до тех пор, пока не будут прослежены как минимум три среза для данного нейрона или пока дендриты больше нельзя будет отследить или найти. С помощью программы извлечения, входящей в систему реконструкции нейронов, откройте завершенный файл реконструкции.

В раскрывающемся меню «Edit» выберите «select all objects». На верхней панели инструментов анализа выберите «branch structure analysis», затем перейдите по каждой вкладке и установите необходимые параметры анализа. Извлеките все нужные данные, нажав кнопку «OK» в окне анализа, и сохраните их в формате электронной таблицы, щелкнув правой кнопкой мыши по окнам вывода и выбрав «export to Excel» для дальнейшего анализа.

На этой фотографии представлен один корональный срез дорсального LGN одного животного. Окрашивание на цитохром-С-оксидазу используется для визуализации слоев LGN. Окрашивание на GFP отмечает место введения вируса.

Стрелка указывает на области с плотным скоплением ретроградно меченых нейронов ретикулярного ядра таламуса. Ориентация среза соответствует представленной схеме дорсально-вентрального и медиально-латерального направлений. Масштабная линейка приведена в левом нижнем углу.

На этом изображении красным цветом показаны контуры LGN, а бордовым — контуры TRN для всех срезов, содержащих места инъекции вируса, которые обозначены черными контурами. Желтые звезды указывают на центры мест инъекции. На данном изображении представлена 3D-визуализация контуров и места инъекции.

На этой карте показано расположение реконструированных нейронов TRN, цветовая кодировка которых соответствует назначению кластера внутри единого общего контура TRN, обозначенного бордовым цветом. Масштабная линейка соответствует 500 microns. На данном изображении общие контуры TRN показаны черным цветом, LGN — серым, а пять реконструированных нейронов TRN окрашены в цвета от теплых к холодным в соответствии с их медиолатеральным положением внутри TRN.

Масштабный отрезок соответствует 500 микронам. На этих фотографиях показаны детали тех же пяти нейронов TRN с соответствующими по цвету масштабными отрезками, представляющими 100 микрон. Данное иерархическое дерево дендрограммы иллюстрирует расстояния связей между 160 реконструированными нейронами TRN на основе 10 независимых морфологических показателей и демонстрирует общие результаты кластерного анализа.

Три отдельных кластера нейронов TRN показаны синим, зеленым и красным цветами. После освоения данных методов реконструкции нейронов один нейрон может быть полностью реконструирован за один-два часа. Важно постоянно контролировать и корректировать глубину по оси z при реконструкции нейронов.

Описанный здесь протокол представляет собой усовершенствованный вариант традиционных, более субъективных методов нейроанатомического анализа и позволяет исследователям изучать новые подклассы нейронов на основе крупномасштабных морфологических данных. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как реконструировать нейроны по соседним срезам ткани и извлекать морфологические данные для дальнейшего анализа.