Масштабные реконструкций и независимой, беспристрастной кластеризация на основе морфологических показателей для Классифицировать Нейроны в селекционных популяциях

Этот протокол описывает крупномасштабные реконструкций селективных популяций нейронов, меченных следующие ретроградной инфекции с модифицированным вирусом бешенства выражения флуоресцентные маркеры, и независимый, беспристрастный кластерный анализ, которые позволяют всестороннюю характеристику морфологических показателей среди различных нейрональных подклассов.

Цели данного протокола заключаются в том, чтобы описать шаги по реконструкции морфологии меченых вирусами нейронов и выполнить независимый, непредвзятый, кластерный анализ популяций меченых нейронов, чтобы обеспечить всестороннюю характеристику морфологических метрик по отдельным подклассам нейронов. Мы описываем новый подход к сбору и анализу нейроанатомических данных, чтобы облегчить более полную выборку и непредвзятую классификацию морфологически уникальных типов нейронов в пределах селективной популяции нейронов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет проводить крупномасштабный анализ морфологии нейронов и использует непредвзятые методы для классификации отдельных подклассов нейронов.

Наиболее сложными аспектами морфологических реконструкций являются выбор хорошо изолированных нейронов для реконструкции, назначение правильной z-глубины и выравнивание беседок для продолжения реконструкций на соседних участках ткани. Начните реконструкцию с выбора предметного стекла с окрашенным 50 микрон срезом ткани мозга примата, которому стереотаксически ввели модифицированный вирус бешенства, экспрессирующий EGFP. Поместите предметное стекло в держатель предметного стекла микроскопа и сфокусируйтесь на одном интересующем вас участке с помощью объектива с малым увеличением.

Убедитесь, что изображение с камеры видно на изображении в реальном времени, правильно расположив затвор камеры. Выберите достаточно изолированный меченый нейрон в интересующей структуре мозга, чтобы обеспечить однозначную реконструкцию дендритной арборизации. Переключитесь на 10-кратное увеличение и сфокусируйте область.

Предпочтительно выбирайте нейроны, если тело клетки полностью находится в пределах одного участка, чтобы точно оценить его площадь и округлость. После того, как хорошо окрашенный, хорошо изолированный нейрон выбран, нажмите кнопку «Новый раздел» в программном обеспечении, чтобы добавить домашний раздел, содержащий тело клетки, в диспетчер разделов. Введите количество разделов, которые будут включены в реконструкцию.

Для начала рекомендуется вставить две-три секции. Назначьте толщину сечения 50 мкм. Выберите две x цели, затем нажмите кнопку контура на верхней панели инструментов и выберите тип контура в выпадающем меню.

Обведите контур целевой структуры, щелкнув мышью по точкам вдоль контура. Когда закончите обводить контур, щелкните правой кнопкой мыши и выберите в меню «Замкнуть контур», чтобы замкнуть контур. Далее, продолжая смотреть на два х, нажмите на нужный символ маркера на левой панели инструментов.

Затем нажмите на центр целевой структуры, чтобы разместить маркер. Когда контуры будут завершены, выберите объектив 40x или 60x, чтобы обвести контур тела клетки. Затем нажмите кнопку отслеживания нейронов на верхней панели инструментов и выберите структуру нейрона для трассировки, в данном случае тело клетки, из выпадающего меню.

Обведите тело клетки, щелкая по точкам вокруг наибольшей протяженности тела клетки, регулируя z-глубину по мере необходимости, чтобы сфокусировать тело клетки. И, щелкнув правой кнопкой мыши, закончите контур тела клетки. Затем поместите маркер другого стиля в центр контура тела клетки, убедившись, что маркер находится примерно в центре по z-глубине.

Очень важно установить правильную z-глубину в домашнем разделе, а также в смежных разделах, прежде чем начинать каждую трассировку, чтобы значения по оси z были точными. Чтобы начать трассировку дендритных оправок, выберите дендрит в верхнем выпадающем меню.

Затем проследите каждый дендрит, начиная с тела клетки. Когда дендрит разветвляется, щелкните правой кнопкой мыши и выберите разветвляющийся узел или трифуркационный узел, чтобы разместить узел в этой точке ветвления. Обязательно отрегулируйте z-глубину по всей трассе, чтобы точно зафиксировать угол и направление дендрита.

В конце дендрита в этом разделе щелкните правой кнопкой мыши и выберите окончание из выпадающего меню. Когда все дендритные беседки будут прослежены в домашней секции, определите те дендритные окончания, которые, скорее всего, продолжатся в соседней секции. И сфокусируйте их на соответствующей z-глубине на изображении микроскопа с кратным увеличением 20x.

Включите в микроскоп основные ориентиры поблизости, такие как кровеносные сосуды или легко узнаваемые дендритные узоры или пучки. Затем сделайте снимок живого изображения с помощью цифровой камеры, приложенной к экрану компьютера. Затем переключите объектив микроскопа на два x и перейдите к соседнему участку на предметном стекле.

Затем совместите контуры ранее обведенного сечения в программном виде с границами ЛГС и РНН в новом сечении. Вернитесь к 20x и выровняйте с помощью ориентиров. Затем, с помощью фотографии окончаний дендритов из ранее обведенного сечения, переместите трассировку, чтобы выровнять дендриты, сначала выбрав реконструкцию с помощью стрелки.

Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Переместить» в выпадающем меню и переместите трассировку соответственно. Чтобы повернуть трассировку, щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Повернуть» в раскрывающемся меню, а затем поверните трассировку соответствующим образом. Кроме того, вы можете выбрать инструмент сопоставления в раскрывающемся списке «Основные инструменты» и указать количество очков для сопоставления.

Затем нажмите на окончание реконструкции и соответствующую точку продолжения в живом изображении, чтобы сопоставить дендритные окончания с началом. После того, как трассировка из предыдущего раздела будет выровнена с дендритами в новом разделе, добавьте новый раздел в менеджер разделов, как и раньше. В качестве альтернативы просто выберите смежный участок, который был создан ранее, и настройте z-глубину таким же образом.

Убедитесь, что в менеджере разделов выбран соответствующий новый раздел, кликнув по текущему разделу. Затем, увеличив увеличение до 40x или 60x, выберите дендрит с помощью стрелки. Щелкните правой кнопкой мыши на конце дендрита из предыдущего раздела и выберите в выпадающем меню пункт «Добавить в окончание».

В запросе будет задан вопрос, находится ли продолжение в новом разделе. Нажмите «Да». Затем обведите продолжение дендрита, используя мышь в качестве инструмента для рисования.

Сделайте снимки концовок, чтобы подготовиться к выравниванию по следующему разделу. Затем добавляйте продолжения к дендритным трассировкам до тех пор, пока не будут прослежены по крайней мере три участка нейрона или пока дендриты больше не будут прослежены или найдены. Используя программу извлечения, связанную с системой реконструкции нейронов, откройте готовый файл реконструкции.

В раскрывающемся меню редактирования выберите «Выбрать все объекты». Выберите анализ структуры ветвей на верхней панели инструментов анализа, а затем нажмите на каждую вкладку и выберите нужные параметры анализа на каждой вкладке. Извлеките все необходимые данные, нажав кнопку OK в окне анализа, и сохраните их в формате электронной таблицы, щелкнув правой кнопкой мыши по выходным окнам и выбрав «Экспорт в Excel» для дальнейшего анализа.

На этой фотографии показан один корональный срез через дорсальную ЛГН одного животного. Окрашивание цитохромоксидазой используется для визуализации слоев ЛГН. А окрашивание GFP помечает место инъекции вируса.

Стрелкой обозначены области плотных, ретроградно меченых нейронов ретикулярного ядра таламуса. Ориентация разреза в соответствии с показанным на рисунке дорсального вентрального медиального латерального компаса. Масштабная линейка изображена в левом нижнем углу.

На этом изображении контурные контуры LGN выделены красным цветом, а TRN — темно-бордовым цветом для всех участков, содержащих инъекцию вируса, как показано черными контурами. Желтыми звездочками обозначены центры мест инъекций. На этом изображении показана 3D-визуализация контуров и места инъекции.

Это карта расположения реконструированных нейронов TRN с цветовой кодировкой в соответствии с распределением кластеров в пределах одного совокупного контура TRN, показанного темно-бордовым цветом. Масштабная линейка представляет собой 500 микрон. На этом изображении показаны совокупные контуры TRN черным цветом и LGN серым цветом с пятью реконструированными нейронами TRN, окрашенными в теплый или холодный цвет в соответствии с их медиальным латеральным положением в TRN.

Масштабная линейка представляет собой 500 микрон. На этих фотографиях показаны детали тех же пяти нейронов TRN с соответствующими по цвету масштабными линейками, представляющими 100 микрон. Это иерархическое дерево дендрограммы иллюстрирует расстояния связи между 160 реконструированными нейронами TRN на основе 10 независимых морфологических метрик и показывает общие результаты кластерного анализа.

Три различных кластера нейронов TRN показаны синим, зеленым и красным цветами. Как только эти методы реконструкции нейронов будут освоены, один нейрон может быть полностью реконструирован за один-два часа. При реконструкции нейронов важно постоянно контролировать и регулировать z-глубину.

Описанный здесь протокол является усовершенствованием традиционных, более предвзятых методов нейроанатомического анализа и позволяет исследователям исследовать новые подклассы нейронов на основе крупномасштабных морфологических данных. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как реконструировать нейроны через соседние участки тканей и извлечь морфологические данные для дальнейшего анализа.