В Utero Электропорация подходы к изучению возбудимости нейрональных субпопуляциях и Connectivity одноклеточные

Общая цель этого подхода к внутриутробной электропорации состоит в том, чтобы охарактеризовать структурную связность и возбудимость корковых нейронов в нормальных и экспериментальных условиях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы нейробиологии развития, такие как анализ структуры и функциональных связей мозга и биологии когнитивных расстройств. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет маркировать разреженную популяцию нейронов и позволяет одеть дендриты и получить доступ к отдельным нейронам, что приводит к более эффективному и более фиметическому количественному анализу.

Перед инъекцией приготовьте десять микролитров смеси ДНК за одну операцию либо для мечения отдельных клеток, либо для стандартного исследования с помощью зажима пластыря. Затем осторожно манипулируйте эмбрионами пальцами, чтобы найти конечный мозг. Далее поместите подготовленный боросиликатный капилляр в ротовую пипетку.

Пропустите кончик иглы через матку, избегая кровеносных сосудов, пока он не достигнет бокового желудочка. После этого медленно вводите примерно один микролитр цветного раствора ДНК Fast Green до тех пор, пока не будет наблюдаться большое синее пятно. Важным этапом в этой процедуре является инъекция ДНК.

Делать это нужно максимально аккуратно. Теперь поместите семимиллиметровые платиновые электроды сбоку на голову эмбриона и подайте напряжение через платиновые электроды. При этой процедуре криопротекция неподвижного мозга в десяти миллилитрах 30% сахарозы в PBS при четырех градусах Цельсия в течение одного-двух дней до тех пор, пока они не опустятся.

Затем подготовьте кубики из алюминиевой фольги в кубе сантиметра и заполните кубики на 2/3 или способом OCT. После этого поместите мозги в кубики и заморозьте их на сухом льду. Впоследствии храните замороженные мозги при температуре 80 градусов по Цельсию.

Чтобы разрезать мозг в криостате, поместите каплю ОКТ на поверхность диска образца. Снимите алюминиевую фольгу с гистологического блока и расположите блок в желаемой ориентации поверх жидкого ОКТ. Надавите сильно, пока гистологический блок не будет зафиксирован

Затем вставьте диск для образцов в головку образца криостата и ориентируйте образец для разрезания. Затем нарежьте срезы толщиной 50-100 микрометров и перенесите плавающие криоразрезы в PBS с помощью тонкой кисти. Затем блокируют срезы на один час при комнатной температуре 5%-ной фетальной бычьей сывороткой в PBS, содержащей 0,5%-ный Тритон Х-100.

Затем инкубируйте их в течение ночи при четырех градусах Цельсия с 1:500 первичным антителом, разведенным в блокирующем растворе. На следующий день вымойте срезы три раза в PBS. Добавьте 1:500 вторичное антитело, разведенное в блокирующем растворе, и инкубируйте срезы в течение одного часа при комнатной температуре.

Затем промойте срезы три раза в PBS. После этого закрасьте срезы dapE в PBS, содержащем 0,5% Triton X-100, в течение десяти минут. Промойте секции PBS и смонтируйте их с помощью монтажного носителя.

Чтобы реконструировать нейроны, получите изображения участков мозга с большим увеличением и высоким разрешением. Затем выберите Tile Scan в программе сбора данных, чтобы охватить область интереса, охватывающую все дендриты и аксональные процессы. Приобретайте достаточное количество стеков по оси Z, чтобы избежать потери информации.

После этого откройте изображение и выберите в меню опцию сегментированной линии. Проведите линию, повторяющую структуру нейрона. Затем перейдите в Анализ, Инструменты, затем менеджер ROI, затем Добавить, чтобы сохранить строку.

Повторите этот процесс для каждого аксона или дендрита анализируемого нейрона. В меню «Диспетчер ROI» нажмите «Измерить», чтобы получить длину. Экспортируйте измерения в текстовый файл или электронную таблицу для анализа.

Чтобы выполнить запись экспрессируемого GFP нейрона от мыши, подвергшейся электропорации GFP, поместите мозг в охлажденную чашку для культивирования. Отрежьте мозжечок маленькими ножницами. Затем подхватите мозг шпателем и промокните его насухо на бумажном полотенце.

Приклейте вентральную каудальную плоскость мозга на держатель вибратома. Поместите держатель на вибратом, наполненный ледяным ACSF, и убедитесь, что вибратомная камера имеет непрерывную карбогенацию. После этого получить острые срезы, разрезав корональные срезы размером 300 микрометров в течение 15 минут.

Затем инкубируйте острые ломтики при температуре 25 градусов Цельсия в течение не менее 60 минут в ACSF, одновременно барботируя с карбогеном. Через 60 минут перенесите срез в камеру записи с помощью пастеровской пипетки или небольшой кисточки. Зажмите ломтик арфой и пропитайте его ACSF со скоростью два миллилитра в минуту.

Чтобы наложить патч на GFP-положительный нейрон, определите местоположение интересующей области через микроскоп в 10-кратном увеличении. Затем найдите GFP-положительную ячейку с помощью цели 60x. Далее заполните записывающий электрод внутриклеточным раствором.

Затем поместите стеклянную пипетку в держатель пипетки. После этого поместите наконечник пипетки в ванну и сосредоточьтесь на наконечнике. Как только пипетка окажется в ванне, подайте положительное давление через систему контроля обратного давления.

Подойдите к интересующей точке под визуальным контролем, сохраняя при этом противодавление в пипетке. При появлении небольшой ямочки на поверхности клетки ослабьте давление. На этом этапе может образоваться герметичное уплотнение с сопротивлением более одного гигаома.

В противном случае приложите легкое отрицательное давление, чтобы облегчить это. Пока уплотнение формируется, доведите удерживающее напряжение зажима до 60 милливольт. Как только гигаомное уплотнение будет сформировано, подайте импульс всасывания, чтобы разорвать клеточную мембрану и разорвать весь клеточный режим.

Как только он перейдет в режим всей ячейки, переключитесь с напряжения на режим тока и начните запись. На этих изображениях показана доставка векторов к нейронам слоя 2/3 с помощью внутриутробной электропорации на эмбриональный 15,5-й день, а корональные срезы были подготовлены на постнатальный 16-й день. Вектор CAG DsRed2 котрансфицировали в качестве контроля.

GFP экспрессируется только в тех нейронах, которые также включают cre, что позволяет рекомбинацию сайтов LoxP в векторе CALNL GFP. Ниже приведено конфокальное изображение дендритных беседок другого слабо помеченного GFP-нейрона с большим увеличением. Это пирамидальный нейрон, электропорированный с помощью GFP, который наблюдался в условиях яркой и зеленой флуоресценции.

Вот типичная, регулярная спайковая реакция электропорированного управляющего нейрона CAG-GFP на слое 2/3. После освоения эта техника может быть выполнена за 30 минут для внутриутробной электропорации и за полдня для записи патч-зажима, если она выполнена правильно. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о том, что операция должна быть проведена как можно быстрее, чтобы снизить стресс матери и увеличить шансы на выживание щенков.

После этой процедуры могут быть использованы другие методы, такие как экспрессия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как связь между экспрессией конкретных генов и их влиянием на развитие суррогатной матери. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии развития к изучению связей и морфологии нейронов у мышей. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать внутриутробную работу для описания структуры и связности нейронов на уровне одной клетки, а также возбудимости флуоресцентно меченных нейронов.