Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении изменений числа копий ДНК в одиночных клетках в масштабах гигантских оснований. Для того чтобы классифицировать геномную гетерогенность в клеточных популяциях, необходимо идентифицировать геномные изменения при разрешении одной клетки. Традиционно это достигалось с помощью цитологических подходов, однако эти методы были ограничены в своей чувствительности и специфичности.

Секвенирование одиночных клеток может обнаруживать различные геномные изменения с повышенной чувствительностью и специфичностью по сравнению с предыдущими подходами, но только при тщательном выполнении. В этой статье мы опишем, как использовать секвенирование одиночных клеток для надежного обнаружения гигантских изменений числа копий в отдельных клетках. Чтобы собрать микроаспиратор, начните с извлечения прозрачного пластикового конца из трубки аспиратора и вставьте узкий конец в один конец трубки из ПВХ длиной в один фут с внутренним диаметром 3/16 дюйма.

Вставьте выходное отверстие шприцевого фильтра 0,2 микрометра в другой конец трубки из ПВХ длиной один фут с внутренним диаметром 3/16 дюйма. Затем вставьте входное отверстие шприцевого фильтра 0,2 микрометра в один конец трубки из ПВХ длиной шесть дюймов с внутренним диаметром 5/16 дюйма. Разбейте пятимиллилитровую пластиковую серологическую пипетку на градусе в один миллилитр и вставьте сломанный конец в открытый конец трубки из ПВХ с внутренним диаметром 5/16 дюйма.

Затем вставьте выпускное отверстие пятимиллилитровой пластиковой серологической пипетки в гибкий конец аспирационной трубки в сборе, затем используйте стерильную пластиковую трубку, чтобы закрыть красный мундштук трубки в сборе для хранения. Вытяните стеклянную капиллярную трубку с внутренним диаметром 10-30 микрометров, расположив середину трубки рядом с пламенем и натянув ее на обоих концах. Разбейте вытянутую трубку на две половины, чтобы получилась две потенциальные аспираторные иглы.

Повторите этот шаг с несколькими пробирками, чтобы убедиться, что подготовлено достаточное количество игл с подходящим внутренним диаметром для выбора отдельных клеток. Для получения адгезивных клеток, таких как клеточные линии фибробластов человека, собирают клетки путем трипсинизации и переносят клетки в коническую трубку, содержащую соответствующую среду. Установите колпак для амплификации всего генома, используя 10% отбеливатель для распыления на поверхность колпака, коробок с наконечниками для пипеток и наконечников для пипеток.

Затем протрите их всем бумажным полотенцем, прежде чем повторить стирку с 70% этанолом. Добавьте восемь микролитров воды из набора для амплификации всего генома (WGA) в отдельные лунки на 96-луночный ПЦР-планшет. Затем накройте 96-луночный ПЦР-планшет крышкой от 96-луночного планшета для культуры тканей и положите планшет на лед.

Затем добавьте 1 000 клеток к 10 миллилитрам среды или PBS в 15-сантиметровую чашку Петри и поставьте чашку на лед, чтобы предотвратить прилипание клеток к чашке. Затем, еще находясь на льду, перенесите клетки в чашке Петри и 96-луночный ПЦР-планшет в световой микроскоп с 10-кратным объективом. Увеличьте раскрытие иглы аспиратора, осторожно постукивая вытянутым концом иглы по твердой поверхности, чтобы кончик отломился.

Затем введите широкий конец иглы в прозрачный конец микроаспиратора. Далее поместите чашку Петри, содержащую клетки, на предметный столик микроскопа. Вставьте красный мундштук аспиратора в рот.

Затем, одновременно с помощью одной нужно было перемещать иглу аспиратора, а другой рукой перемещать чашку Петри, идентифицировать отдельные клетки, подлежащие секвенированию. Используя отсасывание через рот, втяните одну клетку в иглу аспиратора вместе с примерно одним-двумя микролитрами среды или PBS. Перенесите ячейку в восемь микролитров воды в одну лунку 96-луночного ПЦР-планшета.

Качество и полезность данных секвенирования отдельных клеток зависят от состояния каждой клетки и ее генома, поэтому во время подготовки клеток и микроаспирации следует проявлять осторожность для выделения жизнеспособных и неапоптотических клеток. После аспирации каждой клетки и переноса ее в лунку ПЦР-планшета, отметьте лунку, в которую попала клетка. Повторите это для нужного количества ячеек.

Тем временем разморозьте 10-кратный буфер фрагментации лизиса одиночных клеток из набора для амплификации всего генома. Чтобы предотвратить загрязнение во время амплификации всего генома, добавьте все реагенты внутрь колпака для культуры тканей. Используйте наконечники для пипеток с фильтрами и меняйте наконечник для пипетки между лунками.

Для каждого набора до 32 клеток смешайте 32 микролитра 10-кратного буфера для лизиса и фрагментации одиночных клеток и два микролитра раствора протеиназы К в микроцентрифужной пробирке, затем смешайте содержимое пробирки. Добавьте по одному микролитру раствора в каждую лунку и пипеткой вверх и вниз перемешайте. Накройте пластину и с помощью полиэтиленовой пленки загерметизируйте все лунки.

Затем кратковременно центрифугируйте пластину в мини-тарелке-спиннере. Далее пропустите пластину через амплификатор с помощью следующей программы. Затем остудите пластину на льду, и кратковременно центрифугируйте ее.

Чтобы приготовить рабочий буферный раствор для подготовки библиотеки из набора для амплификации всего генома, для каждой клетки соедините два микролитра 1X Single Cell Library Preparation Buffer и один микролитр Library Stabilization Solution. Адекватный лизис клеток и полная фрагментация генома имеют решающее значение для минимизации смещения при амплификации всего генома и обеспечения подготовки высококачественных библиотек секвенирования. Таким образом, позаботьтесь о том, чтобы выполнить эти шаги точно так, как написано.

Снимите с посуды полиэтиленовую пленку и добавьте в каждую лунку по три микролитра раствора. Пипеткой передайте содержимое лунки вверх и вниз для перемешивания, после чего замените полиэтиленовой пленкой. После краткого вращения планшета инкубируйте клетки при температуре 95 градусов Цельсия в течение двух минут, затем охладите планшет на льду и снова кратковременно центрифугируйте планшет.

Теперь снимите пластиковую пленку, добавьте по одному микролитру фермента для подготовки библиотеки в каждую лунку и перемешайте содержимое лунки пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать, затем замените полиэтиленовую пленку. После краткого вращения тарелки поместите ее в амплификатор и запустите следующую программу. Охладив пластину и сделав короткий отжим, приготовьте рабочую смесь для амплификации из набора для амплификации всего генома, смешав 48,5 микролитров воды, 7,5 микролитров мастер-смеси для 10-кратной амплификации и 5 микролитров ДНК-полимеразы WGA для каждой клетки.

Рабочую смесь держать на льду. Снимите с тарелки полиэтиленовую пленку. Добавьте 61 микролитр рабочей амплификационной смеси в каждую лунку и пипеткой перемешайте содержимое каждой лунки вверх и вниз, затем замените полиэтиленовой пленкой.

Кратковременно центрифугируйте планшет и термоцикл следующим образом. Секвенирование образцов и проведение анализа данных в соответствии с текстовым протоколом. Как показано на этом рисунке, если амплификация всего генома прошла успешно, образец будет выглядеть как мазок на агарозном геле.

Слабый мазок или его отсутствие указывает на неудачную реакцию амплификации и не следует секвенировать образец. Как показано здесь, анализ размеров фрагментов проводили с помощью капиллярного электрофореза на анализаторе фрагментов. Успешно подготовленные библиотеки будут иметь довольно равномерное распределение размеров фрагментов от 150 до 900 пар оснований.

Неудачная подготовка библиотеки приведет к неравномерному распределению размеров фрагментов, и такие библиотеки не должны быть упорядочены. С помощью скрытой марковской модели и круговой бинарной сегментации геном каждой клетки был разобран на сегменты с предполагаемым числом копий. В этой таблице показаны перекрывающиеся результаты из одной клетки и выявлен прирост на хромосоме 10 от 67 до 130 мегабаз и прирост на хромосоме 19 от 0 до 20 мегабаз.

Выделение и полногеномная амплификация отдельных клеток может и должна быть выполнена в один день. Подготовка библиотек секвенирования, секвенирование всего генома и анализ данных могут быть выполнены по гибкому графику. Когда выделение клеток и амплификация всего генома выполнены должным образом, а анализ данных выполнен точно так, как описано, изменения числа копий, превышающие пять мегаоснований, могут быть обнаружены с высокой чувствительностью и специфичностью.

В то время как наш протокол конкретно описывает использование секвенирования одиночных клеток для обнаружения изменений числа копий, аспекты этого протокола, такие как выделение одиночных клеток и подготовка библиотеки, могут быть применены для обнаружения других геномных изменений.