Роман диагностики в Ревизионное эндопротезирование: имплантата Sonication и мультиплексной полимеразной цепной реакции
3 декабря 2017 г.
Дифференциальная диагностика в болезненные сустава имеет решающее значение для успеха лечения. Совместное стремление регулярно проводится preoperatively. Описан мультиплексной ПЦР Объединенного аспирата и sonication жидкости, возможно инструмент для обнаружения быстрого возбудителя из этих образцов.
Общая цель процедур, включающих аспирацию суставной жидкости, мультиплексную полимеразную цепную реакцию и соникацию, заключается в предоставлении быстрых и надежных микробиологических результатов хирургам-ортопедам при подозрении на перипротезную инфекцию сустава. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области диагностики и терапии перипротезных инфекций суставов, такие как раннее выявление патогенов и, следовательно, своевременное назначение таргетной терапии. Основным преимуществом этих методов является получение оперативных результатов.
Это позволяет ускорить дифференциальную диагностику при подозрении на перипротезную инфекцию сустава. Положите пациента на смотровой стол в положении лежа на спине. Если планируется пункция коленного сустава, подложите под колено пациента валик, чтобы сустав находился в состоянии легкого сгибания.
Используйте электрическую машинку для стрижки, чтобы укоротить густые или длинные волоски на теле. Затем подготовьте инструментальный стол и оденьтесь для проведения операции в соответствии с текстовым протоколом. После этого используйте кожный антисептик, чтобы тщательно обработать кожу пациента в месте пункции.
Накройте место пункции стерильной фенестрированной салфеткой. Затем определите место пункции через салфетку. С помощью остроконечного скальпеля сделайте небольшой кожный разрез в месте инцизии.
Присоедините канюлю к люэр-замку шприца. Затем введите канюлю через прокол. В области верхнего синовиального рецесса коленного сустава, под верхним полюсом надколенника, направьте иглу под углом 45 градусов дорсально и медиально в сторону рецесса и введите ее на глубину примерно 5 cm.
Осуществите аспирацию суставной жидкости, вытягивая поршень шприца. Для предотвращения образования гематом наложите повязку, а затем забинтуйте место прокола. Используйте спиртовой антисептик для дезинфекции мембраны детского флакона для посева крови.
Затем установите на шприц новую канюлю и введите от 1 до 3 mL аспирированной суставной жидкости в колбу. Перемешайте путем осторожного встряхивания или вращения. Чтобы подготовить образец нативного суставного аспирата, извлеките канюлю из шприца.
Затем откройте пробирку для забора крови без добавок и введите 1 mL аспирата в пробирку. Закройте и плотно зафиксируйте крышку для последующего ПЦР-анализа. Перенесите от 1 до 4 mL общего аспирата в пробирку для забора крови с ЭДТА для подсчета количества и дифференцировки клеток.
Разморозьте пробирку с мастер-миксом, оставив ее при комнатной температуре. Перенесите 180 mcL собранного образца в пробирку для образца. Закройте пробирку крышкой, содержащей протеиназу K и внутренний контрольный ген для контроля качества всего рабочего процесса.
На панели управления откройте операционное программное обеспечение, нажав кнопку New Test в левом нижнем углу. Используя сенсорный экран, введите данные пациента или идентификатор образца. Чтобы выбрать образец из выпадающего списка, сначала выберите ITI Cartridge, затем Orthopedics в качестве режима приложения и, наконец, выберите Synovial Fluid или Sonication Fluid в качестве типа образца. Затем нажмите кнопку Start.
Отсканируйте штрихкод на дне пробирки с образцом. Затем поместите пробирку в Lysator. После этого выберите образец на экране панели управления, чтобы разблокировать пробирку в Lysator.
Затем извлеките пробирку с образцом из лизатора и закройте его верхнюю крышку. Переместите пробирку с образцом в соответствующий слот ПЦР-картриджа. После этого вставьте размороженную пробирку с мастер-миксом в слот для мастер-микса ПЦР-картриджа.
Следуйте инструкциям на мониторе панели управления, чтобы отсканировать ПЦР-картридж с мастер-миксом и пробиркой с образцом. Вставьте ПЦР-картридж в указанный слот для картриджа анализатора. На сенсорном экране панели управления в нижнем левом углу выберите «Active Tests» (Активные тесты), затем выберите соответствующий ID образца для отображения результатов теста.
Сохраните результаты в памяти прибора, затем распечатайте или экспортируйте их для последующего использования. Свяжитесь с микробиологом и введите его в курс дела, чтобы он мог оперативно приступить к анализу образцов. В условиях ламинарного шкафа откройте пластиковый контейнер с извлеченным из операционной протезом и добавьте стерильный 0,9% раствор хлорида натрия до тех пор, пока извлеченное инородное тело не будет покрыто минимум на 80%. Закройте пластиковый контейнер.
Затем тщательно встряхните пластиковый контейнер или перемешайте его содержимое в течение 30 секунд. Поместите пластиковый контейнер в ультразвуковую баню. После этого проверьте уровень жидкости в бане.
Подвергните образец соникации в течение пяти минут при частоте 40 ± 2 кГц и плотности мощности 0,22 ± 0,04 Вт/см². Затем встряхните образец или тщательно перемешайте его на вортексе в течение 30 секунд. В боксе с ламинарным потоком воздуха соберите 50 мл жидкости после соникации и перенесите ее в стерильную пробирку, после чего плотно закройте пробирку.
Для получения концентрированной жидкости для соникации центрифугируйте пробирку при 4200 ×g в течение 10 минут, оставив остаточный объем 10 mL, затем с помощью пипетки удалите оставшийся супернатант. Ресуспендируйте осадок путем пипетирования и перемешивания на вортексе. Инокулируйте каждую колбу с подходящей культуральной средой 0,5 mL концентрированной жидкости для соникации.
Инокулируйте флакон для детского посева крови 2 mL концентрированного раствора после соникации, как показано ранее в этом видео. Затем перенесите 1 mL концентрированного раствора после соникации в стерильную пробирку без добавок для ПЦР-анализа. Перенесите инокулированную культуральную среду в инкубатор.
Инкубируйте культуры в течение 14 дней, ежедневно проверяя наличие роста. Наличие перипротезной инфекции сустава считалось доказанным при наличии одного основного критерия или как минимум трех из пяти второстепенных критериев. Основные критерии включают наличие свища или обнаружение патогена в двух отдельных микробиологических пробах.
К малым критериям относятся: повышенное количество клеток или признаки дифференцировки клеток в аспирате из сустава, повышенный уровень СРБ и скорость оседания эритроцитов в образцах крови, положительные результаты гистологического анализа образцов тканей или обнаружение патогена только в одном микробиологическом образце. Полученные результаты продемонстрировали умеренную чувствительность ПЦР-диагностики жидкости после ультразвуковой обработки и аспирата из сустава, но очень высокую специфичность — 100%. В тех случаях, когда ПЦР давала положительный результат в аспирате из сустава или жидкости после ультразвуковой обработки, тот же патоген впоследствии обнаруживался в одном из традиционных микробиологических посевов. ПЦР различных образцов в случаях отсутствия инфекции не дала ложноположительных результатов.
ПЦР-диагностика не выявила шесть из 16 истинных патогенов в образцах жидкости после ультразвуковой обработки и пять из 13 патогенов в культуре синовиальной жидкости. Комбинированная ПЦР-диагностика обоих материалов, аспирата из сустава и жидкости после ультразвуковой обработки, позволила правильно определить 12 из 18 случаев инфекции. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как оптимизировать диагностический поиск при перипротезной инфекции сустава.
Вы можете видеть, насколько тесным должно быть взаимодействие микробиологов и хирургов-ортопедов для максимально эффективного проведения дифференциальной диагностики. При правильном выполнении вы получите клинически значимые результаты мультиплексной ПЦР на основе картриджей в течение пяти часов после аспирации суставной жидкости. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости соблюдения стерильности на протяжении всего процесса.
Не забывайте, что работа с образцами тканей человека или микробиологическими образцами может быть крайне опасной. При выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать все меры предосторожности, включая использование средств индивидуальной защиты.
Обзор
В данной статье рассматривается важность дифференциальной диагностики при болевом синдроме после эндопротезирования, с особым акцентом на аспирацию суставной жидкости и использование мультиплексной полимеразной цепной реакции для выявления патогенов. Эти методы направлены на получение быстрых и надежных микробиологических результатов для хирургов-ортопедов при подозрении на перипротезную инфекция сустава.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Ортопедическая хирургия
- Микробиология
- Диагностика инфекций
Обзор
- Болезненная артропластика требует точной диагностики для эффективного лечения.
- Аспирация суставной жидкости является стандартной предоперационной процедурой.
- Мультиплексная ПЦР и соникация являются новыми инструментами для обнаружения патогенов.
- Быстрое получение результатов может существенно повлиять на тактику лечения.
Цель исследования
- Для повышения точности диагностики при подозрении на перипротезную инфекцию сустава.
- Для ускорения идентификации патогенов с целью проведения таргетной терапии.
- Для оценки эффективности методов аспирации жидкости из сустава и соникации.
Используемые методы
- Аспирация суставной жидкости, проведенная в стерильных условиях.
- Мультиплексный ПЦР-анализ суставного аспирата и жидкости после ультразвуковой обработки.
- Ультразвуковая обработка эксплантированных протезов для выделения патогенов.
- Оценка диагностических критериев перипротезной инфекции сустава.
Основные результаты
- Продемонстрирована умеренная чувствительность ПЦР-диагностики жидкости после соникации.
- Определены ключевые диагностические критерии для подтверждения инфекций.
- Подчеркнута важность оперативного получения результатов микробиологических исследований.
- Предложен структурированный подход для хирургов-ортопедов.
Выводы
- Аспирация из сустава и мультиплексная ПЦР эффективны для экспресс-диагностики.
- Раннее обнаружение патогенов позволяет своевременно начать лечение.
- Данные методы улучшают тактику ведения пациентов с перипротезными инфекциями суставов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Точная и быстрая диагностика перипротезной инфекции суставов (ППИС) имеет решающее значение для своевременного терапевтического вмешательства и снижения нагрузки, связанной с ревизионным эндопротезированием. Интеграция ультразвуковой обработки имплантата (соникации) с мультиплексной ПЦР представляет собой высокоспецифичный диагностический подход, который способствует раннему выявлению патогенов и принятию обоснованных решений о лечении. Данная методология повышает достоверность диагностики в области ортопедических исследований и разработок, обеспечивая воспроизводимые микробиологические результаты, которые могут быть использованы для оценки стратегий применения антимикробных препаратов и моделей инфекций, связанных с имплантатами.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет определять наличие патогенов в биопленках, связанных с имплантатами, для подтверждения мишеней при инфекционных заболеваниях.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированный метод извлечения малочисленных микроорганизмов с поверхностей имплантатов для проведения механистических исследований.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные на основе мультиплексной ПЦР из жидкости после соникации для обеспечения стандартизации и воспроизводимости анализа.
- Практическая ценность: обеспечивает получение быстрых результатов в течение пяти часов, что позволяет проводить высокопроизводительный скрининг антимикробных соединений против патогенов, вызывающих PJI.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует разработке релевантных моделей инфекций при заболеваниях с использованием эксплантированных протезов для оценки взаимодействий между хозяином и патогеном.
- Практическая ценность: облегчает продольный отбор проб и оценку микробной нагрузки в доклинических моделях инфекций имплантатов.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в рабочий процесс диагностики инфекций — от сбора образца до идентификации патогена, обеспечивая плавный переход от аспирации суставной жидкости к молекулярному анализу в доклинических и трансляционных исследованиях.
- Биология открытий: Поддерживает проверку гипотез относительно образования биопленок и жизнеспособности патогенов на поверхностях имплантатов.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизированную подготовку жидкости для соникации для проведения воспроизводимых тестов на антимикробную чувствительность.
- Аналитика: Обеспечивает результаты мультиплексной ПЦР, которые позволяют одновременно обнаруживать несколько патогенов, повышая диагностическое разрешение.
- Трансляционные исследования: Связывает анализ эксплантатов, полученных в ходе операции, с доклинической валидацией моделей инфекции посредством стандартизированного выделения патогенов.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для тестирования инфекций, связанных с имплантатами, в рамках нескольких программ исследований и разработок в области ортопедии.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Высокая специфичность (100%) снижает количество ложноположительных результатов при определении патогенов, что повышает достоверность валидации мишеней и механистических исследований.
- Эксплуатационная ценность: Стандартизированные рабочие процессы соникации и ПЦР улучшают воспроизводимость результатов в разных лабораториях и центрах.
- Стратегическая ценность: Короткие сроки выполнения анализа позволяют быстрее принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) в программах создания антимикробных препаратов.
- Влияние на портфель разработок: Обеспечивает продвижение кандидатов с учетом стратификации рисков на основе подтвержденного наличия патогенов в моделях инфекции.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами асептики, аспирации суставной жидкости и процедурами соникации.
- Необходим доступ к ультразвуковым ваннам, ламинарным шкафам и картриджным ПЦР-анализаторам.
- Требуется междисциплинарное взаимодействие между отделениями ортопедии, микробиологии и научно-исследовательскими группами для обработки и интерпретации образцов.
- Адаптация метода под различные материалы имплантатов и типы суставов может потребовать валидации эффективности соникации.
- Чувствительность ПЦР умеренная, что делает необходимым использование дополнительных методов культурального посева для комплексного выявления патогенов.
