Unravelling функцию Бактериальный эффектора от Non-возделываемых растений Возбудитель Использование дрожжей дигибридная экрана

Бактериальные эффекторные белки имеют важное значение для создания успешных инфекций. Этот протокол описывает экспериментальную идентификацию белковыми связывающих партнеров бактериального эффекторной белка в его естественном растения-хозяина. Выявление этих эффекторных взаимодействий через дрожжей двух гибридных экранов стала важным инструментом в разгадке стратегии молекулярных патогенности.

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы разгадать вирулентные стратегии и системы патогенов хозяина путем идентификации взаимодействия белка-вредителя фитоплазмы Candidatus с белками хозяина из malus domestica. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы во многих различных областях биологических исследований и используется в исследованиях растений для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе развития болезни пролиферации яблок. Основное преимущество этого метода заключается в том, что один эффектор патогена может быть проверен на тысячу потенциальных взаимодействующих агентов, что делает этот метод легко осуществимой отправной точкой в исследованиях инфекций.

Для начала определите зараженные деревья с симптомами, характерными для пролиферации яблок, и контролируйте деревья без симптомов. С помощью чистых секаторов срезайте образцы корней с трех разных участков корневой системы, которые имеют диаметр от 0,5 до 1 см, и длину около 5 см. Поместите образцы корней в полиэтиленовые пакеты с соответствующей маркировкой.

Затем поместите образцы в холодный бокс с охлажденными термопакетами и храните их при температуре четыре градуса Цельсия до дальнейшей обработки. Промойте образцы корней водой, чтобы удалить почву. Затем переложите образцы в стерильную чашку Петри и с помощью стерилизованного скальпеля удалите корневой эпидермис и кору головного мозга.

Чистой, безворсовой салфеткой протрите скальпель. Затем окуните инструмент в 70% этанол и стерилизуйте его при нагревании на открытом огне. С помощью скальпеля поцарапайте флоэму.

Нарежьте образец на мелкие кусочки и добавьте 30-100 миллиграммов кусочков в стерильную двухмиллилитровую реакционную пробирку. Храните образцы при температуре 80 градусов Цельсия или используйте их сразу для выделения ДНК, которая служит матрицей для амплификации генов эффектора и последующего клонирования эффектора в вектор-приманку. После выделения полиспецифической ДНК фитоплазмы из зараженных деревьев, клонирования в векторы-приманки и тестирования ее на самоактивацию и экспрессию по текстовому протоколу.

Эффектор Streak plex A ATP 00189 преобразовал NMY51 на свежий планшет SD-trp и культивировал его при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух-трех дней, пока не появятся красные колонии. С помощью красной колонии из агаровой пластины ввести три миллилитра среды SD-trp в небольшую колбу для встряхивания и инкубировать культуру в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием со скоростью 120-150 оборотов в минуту. На следующий день одним миллилитром ночной культуры внесите 20 миллилитров SD-trp в колбу для встряхивания и дайте ей расти в течение восьми часов.

Используйте среду SD-trp для доведения культуры до OD600 0,2 и с десятью миллилитрами культуры инокулируйте две колбы, содержащие по 100 миллилитров среды SD-trp в каждой. Инкубируйте культуры при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием на ночь. Далее измерьте ОД600 культуры и гранулы ОД600 ЕД.

Например, если измерен OD600 равный 1,2, открутите 100 миллилитров образца, выбросьте надосадочную жидкость и используйте 800 миллилитров предварительно подогретого 2xYPAD для ресуспендирования гранулы в двух колбах-шейкеров и инкубируйте при 30 градусах Цельсия. Инкубируют дрожжевую культуру при температуре 30 градусов Цельсия и 120-150 оборотах в минуту. Измеряйте OD600 примерно каждые 1,5 часа в соответствии с текстовым протоколом до тех пор, пока не будет достигнут OD600, равный 0,6.

После подготовки ДНК спермы лосося, Te Lithium OAc и PEG Lithium OAc в соответствии с текстовым протоколом, центрифугируйте 800 миллилитров культуры дрожжей при 700 x G в течение пяти минут для гранулирования клеток. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы в общей сложности в 200 миллилитрах стерильной воды двойной дистилляции. Затем снова гранулируйте клетки и выбросьте надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте гранулу в 16 миллилитрах смеси Te Lithium OAc и снова раскрутите образец. Затем, выбросив надосадочную жидкость, используйте 9,6 миллилитров Te Lithium OAc для ресуспендирования гранулы. В реакционных сосудах соответствующего размера приготовьте двенадцать флаконов с семью микрограммами пикового вектора из библиотеки ДНК HAC, 100 микролитрами 2% ДНК спермы лосося и 2,5 мл смеси PEG Lithium OAc.

Добавьте по 600 микролитров приготовленной ранее суспензии дрожжевых клеток в каждый из двенадцати флаконов и энергично перемешайте в течение одной минуты. Затем инкубируйте реакции на водяной бане при температуре 30 градусов Цельсия в течение 45 минут, перемешивая каждые 15 минут. Затем добавьте по 160 микролитров ДМСО в каждый флакон и энергично перемешайте.

Затем инкубируйте флаконы при температуре 42 градуса Цельсия еще 20 минут. После гранулирования клеток выбросьте надосадочную жидкость и используйте три миллилитра 2xYPAD для ресуспендирования каждой гранулы. Соберите клетки из всех двенадцати флаконов в колбе объемом 100 миллилитров и инкубируйте дрожжи в течение 90 минут при температуре 30 градусов Цельсия и 120 оборотах в минуту.

После инкубации, после гранулирования клеток и отбрасывания надосадочной жидкости, используйте десятимиллилитровую серологическую пипетку и 4,5 миллилитров стерильной 0,9% хлорида натрия для тщательной ресуспендации гранулы путем тщательного пипетирования вверх и вниз. Отведите 50 микролитров суспензии и используйте 0,9% натрия хлорида для приготовления десятикратных разведений от 1:10 до 1:1000. Затем нанесите на тарелку по 100 микролитров каждого разбавления на 90-миллиметровые чашки Петри, содержащие агар SD-trp-лей.

Разложите оставшуюся неразбавленную дрожжевую суспензию по чашкам Петри диаметром 16х150 миллиметров с агаром SD-trp-leu-His-ade. Инкубируйте планшеты при температуре 30 градусов Цельсия в течение трех дней для планшетов SD-trp-leu и в течение четырех дней для планшетов SD-trp-leu-his-ade. Определите эффективность трансфекции путем подсчета колоний различных серийных разведений на селекционных планшетах SD-trp-leu.

Перенесите каждый клон с помощью стерильного наконечника для пипетки, чтобы отобрать и насадить колонию на свежие селективные планшеты SD-trp-leu-his-ade. Инкубируйте пластины при температуре 30 градусов Цельсия в течение 24 часов. Повторяйте перенос клонов каждый день, пока не будет достигнуто в общей сложности пять проходов.

Для анализа клонов под стерильным колпаком приготовьте одну стерильную двухмиллилитровую реакционную пробирку с одним миллилитром SD-trp-leu-his-ade для каждого клона. С помощью горячей иглы проделайте отверстие в каждой трубке и закройте отверстие газопроницаемым герметиком. Инокулируйте каждый флакон свежим материалом колонии от одного клона и инкубируйте флаконы при температуре 30 градусов Цельсия и 150 оборотах в минуту в течение 24 часов.

После гранулирования клеток и отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в соответствующем буфере и переложите ее в свежую двухмиллилитровую реакционную пробирку. Добавьте в суспензию 100 микролитров промытых кислотой стеклянных шариков и энергично перемешивайте тюбик в течение пяти минут. Наконец, очистите плазмидную ДНК в соответствии с текстовым протоколом.

Краткое изложение ожидаемых результатов анализа самоактивации и их интерпретация приведены в данной таблице и на рисунке. Слабая самоактивация приводит к росту на trp-leu-his, но не на trp-leu-his-ade истощенных селекционных пластинах. В то время как дрожжи трансформировались с помощью сильной самоактивирующейся приманки, на trp-leu-his-ade не хватало среды.

Успешная котрансформация приманки и добычи характеризуется ростом на селективных пластинах, лишенных trp и leu. Взаимодействие приманки и белка добычи приводит к комплементации гис и аде окситрофии NMY51 Здесь показан пример взаимодействия между приманкой и добычей в эксперименте с гибридом дрожжей 2. Партнеры по взаимодействию с хозяином malus domestica, MdTCP24 и MdTCP25, были идентифицированы, и взаимодействие было подтверждено путем преобразования конуса деново с эффектором.

После освоения гибрид дрожжей 2 может быть выполнен за один день, если все необходимое оборудование и материалы, особенно дрожжи, будут правильно подготовлены заранее. При попытке выполнить эту процедуру важно избегать загрязнения и всегда работать в стерильных условиях. После этой процедуры необходимо выполнить другой независимый метод, например, бимолекулярную флуоресцентную комплементацию, чтобы подтвердить обнаруженные белок-белковые взаимодействия.

Это особенно важно, поскольку дрожжи или гибрид сами по себе относительно склонны к получению ложноположительных результатов. После своего развития этот метод проложил путь исследователям во многих различных областях исследований, чтобы лучше понять молекулярные принципы, которые включали белок-белковые взаимодействия, особенно во взаимодействиях хозяина и патогена, а также во многих других областях биологических исследований. Кроме того, вы поймете, что выполнение этого метода легко осуществимо в любой прилично оборудованной лаборатории молекулярной биологии.

Не забывайте, что работа с определенными химическими веществами, скальпелями и открытым огнем может быть крайне опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда нужно учитывать определенные меры предосторожности. Это означает, что используйте средства индивидуальной защиты, такие как перчатки и защитные очки, а также используйте общее лабораторное оборудование для обеспечения безопасности.