Unravelling функцию Бактериальный эффектора от Non-возделываемых растений Возбудитель Использование дрожжей дигибридная экрана

Общая цель данной процедуры заключается в раскрытии стратегий вирулентности и систем взаимодействия хозяина и патогена путем идентификации взаимодействия белка-фактора Candidatus Phytoplasma Malefactor с белками хозяина Malus domestica. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы во многих различных областях биологических исследований и используется здесь в исследованиях растений для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе развития болезни «разрастание плодов» яблони (Apple Proliferation Disease). Основным преимуществом данного метода является то, что один эффектор патогена может быть проверен на взаимодействие с тысячами потенциальных партнеров, что делает этот метод доступной и эффективной отправной точкой в исследованиях инфекционных процессов.

Для начала выберите деревья, инфицированные и проявляющие специфические симптомы разрастания побегов яблони (Apple Proliferation), а также контрольные деревья без симптомов. С помощью чистых секаторов возьмите образцы корней из трех разных участков корневой системы диаметром 0,5–1 cm и длиной около 5 cm. Поместите образцы корней в пластиковые пакеты с соответствующей маркировкой.

Затем поместите образцы в термоконтейнер с охлажденными хладоэлементами и храните их при температуре 4 °C до начала дальнейшей обработки. Промойте образцы корней водой для удаления почвы. Затем перенесите образцы в стерильную чашку Петри и с помощью стерильного скальпеля удалите эпидермис и кору корня.

Протрите скальпель чистой безворсовой салфеткой. Затем погрузите инструмент в 70% ethanol и проведите термическую стерилизацию над открытым пламенем. С помощью скальпеля сделайте надрез флоэмы.

Разрежьте образец на мелкие кусочки и перенесите 30-100 миллиграммов кусочков в стерильную реакционную пробирку объемом два миллилитра. Храните образцы при 80 градусах Цельсия или используйте их немедленно для выделения ДНК, которая служит матрицей для амплификации гена эффектора и последующего клонирования эффектора в приманочный вектор. После выделения полиспецифической ДНК фитоплазмы из зараженных деревьев проведите клонирование в приманочные векторы и проверьте на самоактивацию и экспрессию в соответствии с текстовым протоколом.

Высейте штрихом трансформированный эффектором NMY51 штамм plex A ATP 00189 на свежую чашку с средой SD-trp и культивируйте при 30 °C в течение двух-трех дней до появления красных колоний. Используя красную колонию с агарной чашки, инокулируйте 3 мл среды SD-trp в небольшой колбе на встряхивателе и инкубируйте культуру в течение ночи при 30 °C с перемешиванием при 120-150 об/мин. На следующий день, используя 1 мл ночной культуры, инокулируйте 20 мл среды SD-trp в колбе на встряхивателе и культивируйте в течение восьми часов.

Используйте среду SD-trp для доведения культуры до OD600 0,2, затем с помощью десяти миллилитров культуры инокулируйте две колбы, содержащие по 100 миллилитров среды SD-trp каждая. Инкубируйте культуры при 30 °C с встряхиванием в течение ночи. Затем измерьте OD600 культуры и осадите 120 единиц OD600.

Например, если измеренное значение OD600 составляет 1,2, центрифугируйте 100 миллилитров образца, удалите супернатант и используйте 800 миллилитров предварительно нагретой среды 2xYPAD для ресуспендирования осадка в две колбы-шейкеры, затем инкубируйте при 30 градусах Цельсия. Инкубируйте культуру дрожжей при 30 градусах Цельсия и 120-150 оборотах в минуту. Измеряйте OD600 примерно каждые 1,5 часа согласно текстовому протоколу до достижения значения OD600 0,6.

После подготовки ДНК спермы лосося, Te Lithium OAc и PEG Lithium OAc согласно текстовому протоколу, центрифугируйте 800 миллилитров культуры дрожжей при 700 x G в течение пяти минут для осаждения клеток. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в общем объеме 200 миллилитров стерильной дважды дистиллированной воды. Затем снова осадите клетки и удалите супернатант.

Ресуспендируйте осадок в 16 миллилитрах смеси Te Lithium OAc и снова центрифугируйте образец. Затем, после удаления супернатанта, используйте 9,6 миллилитра Te Lithium OAc для ресуспендирования осадка. В подходящих по размеру реакционных сосудах подготовьте двенадцать пробирок, содержащих семь микрограмм вектора библиотеки peak Add HAC DNA, 100 микролитров 2% ДНК семенной жидкости лосося и 2,5 миллилитра смеси PEG Lithium OAc.

Добавьте 600 µL предварительно приготовленной суспензии клеток дрожжей в каждую из двенадцати пробирок и интенсивно перемешивайте в течение одной минуты. Затем инкубируйте реакционные смеси на водяной бане при 30 °C в течение 45 минут, перемешивая каждые 15 минут. Затем добавьте 160 µL DMSO в каждую пробирку и интенсивно перемешайте.

Затем инкубируйте пробирки при 42 °C еще в течение 20 минут. После осаждения клеток удалите супернатант и используйте 3 мл 2xYPAD для ресуспендирования каждого осадка. Объедините клетки из всех двенадцати пробирок в колбе-шейкере объемом 100 мл и инкубируйте дрожжи в течение 90 минут при 30 °C и 120 об/мин.

После инкубации, центрифугирования клеток для получения осадка и удаления супернатанта, используйте серологическую пипетку объемом десять миллилитров и 4,5 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия для тщательного ресуспендирования осадка путем осторожного перемешивания пипеткой. Отоберите 50 мкл суспензии и с помощью 0,9% раствора хлорида натрия приготовьте десятикратные разведения от 1:10 до 1:1000. Затем высейте по 100 мкл каждого разведения в чашки Петри диаметром 90 мм с агаром SD-trp-leu.

Распределите оставшуюся неразбавленную суспензию дрожжей по чашкам Петри диаметром 16x150 мм с агаром SD-trp-leu-His-ade. Инкубируйте чашки при 30 °C в течение трех дней для чашек SD-trp-leu и четырех дней для чашек SD-trp-leu-his-ade. Определите эффективность трансфекции, подсчитав количество колоний различных серийных разведений на селекционных чашках SD-trp-leu.

Перенесите каждый клон, используя стерильный наконечник дозатора, чтобы взять колонию и произвести посев штрихом на свежие селективные чашки SD-trp-leu-his-ade. Инкубируйте чашки при 30 °C в течение 24 часов. Повторяйте перенос клонов ежедневно до достижения общего количества в пять пассажей.

Для анализа клонов в стерильном боксе подготовьте одну стерильную реакционную пробирку объемом 2 мл с 1 мл среды SD-trp-leu-his-ade для каждого клона. С помощью раскаленной иглы проколите отверстие в каждой пробирке и закройте его газопроницаемой заглушкой. Инокулируйте каждую пробирку свежим материалом колонии одного клона и инкубируйте пробирки при 30 °C и 150 об/мин в течение 24 часов.

После осаждения клеток и удаления супернатанта ресуспендируйте осадок в соответствующем буфере и перенесите его в новую реакционную пробирку объемом два миллилитра. Добавьте в суспензию 100 µL стеклянных шариков, промытых кислотой, и интенсивно перемешивайте содержимое пробирки в течение пяти минут. В завершение очистите плазмидную ДНК согласно текстовому протоколу.

Резюме ожидаемых результатов анализа самоактивации и их интерпретация представлены в данной таблице и на рисунке. Слабая самоактивация приводит к росту на селективных чашках с дефицитом trp-leu-his, но не на чашках с дефицитом trp-leu-his-ade. В то время как дрожжи, трансформированные сильной самоактивирующей приманкой, будут расти на среде без trp-leu-his-ade.

Успешная котрансформация приманки и жертвы характеризуется ростом на селективных средах, в которых отсутствуют trp и leu. Взаимодействие белка-приманки и белка-жертвы приводит к комплементации окзитрофии по his и ade у штамма NMY51. Здесь представлен пример взаимодействия приманки и жертвы в эксперименте по дрожжевой двухгибридной системе. Были идентифицированы партнеры по взаимодействию с хозяином malus domestica, MdTCP24 и MdTCP25, и взаимодействие было подтверждено трансформацией конуса de novo эффектором.

После освоения метода дрожжевой двухгибридной системы анализ может быть проведен за один день, если всё необходимое оборудование и материалы, особенно дрожжи, будут надлежащим образом подготовлены заранее. При выполнении данной процедуры крайне важно избегать контаминации и всегда работать в стерильных условиях. После применения этого метода необходимо провести другой независимый анализ, например, бимолекулярную флуоресцентную комплементацию, чтобы подтвердить обнаруженные белок-белковые взаимодействия.

Это особенно важно, так как сами дрожжи или гибриды относительно склонны к выдаче ложноположительных результатов. После разработки этот метод открыл перед исследователями во многих различных областях возможность лучше понять молекулярные принципы белок-белковых взаимодействий, особенно при взаимодействии хозяина и патогена, а также в многих других областях биологических исследований. Кроме того, вы поймете, что выполнение этого метода легко осуществимо в любой достаточно оснащенной лаборатории молекулярной биологии.

Помните, что работа с определенными химическими веществами, скальпелями и открытым огнем может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать определенные меры предосторожности. Это означает, что следует использовать средства индивидуальной защиты, такие как перчатки и защитные очки, а также общее лабораторное оборудование по технике безопасности.