Name: Синтез 1,2-Azaborines и подготовке их белковых комплексов с Т4 лизоцима Мутанты (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Изучите синтез 1,2-азаборинов и подготовку их комплексов с мутантами Т4 лизоцима. Этот надёжный метод позволяет получать борсодержащие изостеры бензола для биомедицинских исследований.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения NIGMS (R01-GM094541) и Бостонским колледжем.

<ol><li>Ducruix, A., Giége, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDucruix%2C+A+%22Crystallization+of+Nucleic+Acids+and+Proteins%2C+A+Practical+Approach%22">Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach</a>. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).</li>
<li>Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v08-110#.WLBilzsrLIU">B-N as a C-C substitute in aromatic systems.</a> Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).</li>
<li>Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22644658">Recent Advances in Azaborine Chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).</li>
<li>Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25469827">Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties.</a> Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).</li>
<li>Zhou, H. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+isomerism%3A+a+boron-nitrogen+surrogate+for+a+carbon-carbon+double+bond+increases+the+chemical+diversity+of+estrogen+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands.</a> Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).</li>
<li>Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+binding+property+of+isoelectronic+analogues+of+nucleobases%2C+B%286%29-substituted+5-aza-6-borauracils+and+-thymines%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines.</a> Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).</li>
<li>Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BN%2FCC+isosterism+in+borazaronaphthalenes+towards+phosphodiesterase+10A+%28PDE10A%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors.</a> Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).</li>
<li>Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzazaborinines+as+Novel+Bioisosteric+Replacements+of+Naphthalene%3A+Propranolol+as+an+Example%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example.</a> J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).</li>
<li>Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja01060a034">New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene.</a> J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).</li>
<li>White, D. G. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00905a022">2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes.</a> J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).</li>
<li>Ashe III, A. J., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Synthesis+of+Aromatic+Five-+and+Six-Membered+B%E2%88%92N+Heterocycles+via+Ring+Closing+Metathesis%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis.</a> Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).</li>
<li>Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hybrid+Organic%2FInorganic+Benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Hybrid Organic/Inorganic Benzene.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).</li>
<li>Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+Group-Free+Synthesis+of+1%2C2-Azaborines%3A+A+Simple+Approach+to+the+Construction+of+BN-Benzenoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).</li>
<li>Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodium-catalyzed+boron+arylation+of+1%2C2-azaborines%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).</li>
<li>Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negishi+Cross-Coupling+Is+Compatible+with+a+Reactive+B-Cl+Bond%3A+Development+of+a+Versatile+Late-Stage+Functionalization+of+1%2C2-Azaborines+and+Its+Application+to+the+Synthesis+of+New+BN+Isosteres+of+Naphthalene+and+Indenyl%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl.</a> J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).</li>
<li>Knack, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23355270">BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).</li>
<li>Eriksson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+a+Protein+Structure+to+Cavity-Creating+Mutations+and+Its+Relation+to+the+Hydrophobic+Effect%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect.</a> Science. 255 (5041), 178-183 (1992).</li>
<li>Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cavity-containing+mutant+of+T4+lysozyme+is+stabilized+by+buried+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene.</a> Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).</li>
<li>Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetic+Origins+of+Specificity+of+Ligand+Binding+in+an+Interior+Nonpolar+Cavity+of+T4+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme.</a> Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).</li>
<li>Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+Binding+Site+for+Testing+Scoring+Functions+in+Molecular+Docking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking.</a> J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).</li>
<li>Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+Bonding+of+1%2C2-Azaborines+in+the+Binding+Cavity+of+T4+Lysozyme+Mutants%3A+Structures+and+Thermodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics.</a> J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).</li>
<li>Brown, H. C., Racherla, U. S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/280707532_Organoboranes_43_A_convenient_highly_efficient_synthesis_of_triorganylboranes_via_a_modified_organometallic_route">Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route.</a> J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halogenated+Benzenes+Bound+within+a+Non-polar+Cavity+in+T4+Lysozyme+Provide+Examples+of+I.S+and+I.Se+Halogen-bonding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding.</a> J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).</li>
</ol>

Все авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов в данной рукописи.

В первой части этого протокола, мы описали модифицированный синтез 1,2-azaborines на основе ранее представленных методов 12, 13. Triallylborane 22 был использован в качестве замены для маршрутов с использованием allyltriphenyl олова или калия allyltrifluoroborate подготовить N -allyl- N -TBS- B аллил аддукт хлорид (1). Этот метод позволяет более атомно-экономичной и экологически чистой подход. Д...

Бором азотсодержащие гетероциклы (например , 1,2-azaborines) недавно обращено значительное внимание как изостерами аренов. Это isosterism может привести к изменению существующих структурных мотивов для расширения химического пространства 2, 3, 4. Azaborines имеют потенциальную полезность для применения в биомедицинских исследованиях , 5, 6, 7, 8, особенно в области медицинской химии , в которой химики осуществляют синтез библиотек структурно и функционально соответствующих молекул. При этом , однако, в то время как существуют многочисленные хорошо развитые путей синтеза , доступных аренов , содержащих молекулы, только ограниченное количество методов синтеза azaborines было зарегистрировано 9, 10, </sдо&gt; 11, 12, 13. Это происходит главным образом из-за ограниченного числа вариантов источника бора и воздухо- и влаго- чувствительной природы молекулы в ранней стадии последовательности синтеза. В первой части этой статьи мы опишем несколько грамм масштабный синтез N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3) с использованием стандартных методов без доступа воздуха с. Это соединение служит универсальным промежуточного продукта, который может быть дополнительно функционализированный структурно более сложных молекул 14, 15. Начиная с 3, синтез и очистка N -H- B - этил-1,2-azaborine (5) для использования в исследованиях связывания белков будут описаны ниже. Из - за волатильности 5, его эффективная изоляция требует точного контроля температуры реакции, времени и дистусловия. вывод Во второй части, протоколы для экспрессии белка , и выделения Т4 лизоцима мутантов (L99A и L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 будут представлены, с последующей кристаллизации белков и получения белок-лиганд кристаллических комплексов. T4 лизоцима мутанты L99A и L99A / M102Q были выбраны в качестве модельных систем для изучения биологических возможности водородных связей NH , содержащих молекулы azaborine 17. Использование стандартного протокола молекулярной биологии, белок экспрессируется в штамм кишечной палочки RR1 и индуцировали изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). очистки белка проводят с использованием ионообменной хроматографии на колонках. Протеин кристаллизацию проводят с высокой концентрацией очищенного раствора белка (&gt; 95% чистоту с помощью электрофореза в геле) с использованием нависаниюпадение пара методом диффузии. Из-за чувствительности лигандов этого исследования к кислороду, белок-лиганд комплексы получают в Деаэрированная условиях.

<table><tbody><tr><td>Тетрагидрофуран (ТГФ), не содержащий ингибиторов, для ВЭЖХ, &ge; 99,9%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34865</td><td></td></tr><tr><td>Диэтиловый эфир (Et2O), для ВЭЖХ, &ge; 99,9%, не содержит ингибиторов</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>метиленхлорида; (CH2Cl2), (стабилизированный/сертифицированный ACS)</td><td>Fisher</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>Толуол</td><td></td><td>Fisher T290-4</td><td></td></tr><tr><td>Пентан, ВЭЖХ</td><td>Fisher</td><td>P399-4</td><td></td></tr><tr><td>Ацетонитрил</td><td>Fisher</td><td>A21-4</td><td></td></tr><tr><td>Гидрид кальция (CaH2), реагентный класс, 95%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>208027</td><td>Пирофорный</td></tr><tr><td>палладий на активированном угле (Pd/C), 10 мас.% Pd</td><td>Strem</td><td>46-1900</td><td></td></tr><tr><td>1,0 М раствор трихлорида бора в гексане</td><td>Sigma Aldrich</td><td>211249</td><td>высокотоксичный/пирофорный</td></tr><tr><td>триэтиламин, &ge; 99,5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td></td></tr><tr><td>Grubbs 1st генерация&nbsp;</td><td>materia</td><td>C823</td><td></td></tr><tr><td>Acetamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0500</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol, безводный, 99,8%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>281549</td><td></td></tr><tr><td>раствор этиллития, 0,5&nbsp; M в бензоле/циклогексане</td><td>Sigma Aldrich</td><td>561452</td><td>Высокотоксичный/Пирофорный</td></tr><tr><td>раствор HCl, 2,0 М в Et2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>455180</td><td></td></tr><tr><td>2-метилбутан, безводный, &ge; 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC&reg; 31343&trade;)</td><td>ATCC</td><td>31343</td><td></td></tr><tr><td>Т4 лизоцим WT* (L99A)</td><td>Addgene</td><td>18476</td><td></td></tr><tr><td>T4 лизоцим мутант (S38D L99A M102Q N144D)</td><td>Addgene</td><td>18477</td><td></td></tr><tr><td>Ампициллина натриевая соль</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>изопропил-&бета;-D-1-тиогалактопиранизид (IPTG)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>Фосфат натрия одноосновной безводный</td><td>Fisher</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>Фосфат натрия двухосновной безводный</td><td>Fisher</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>Хлорид натрия</td><td>Fisher</td><td>S642212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Этилендиаминтетрауксусная кислота</td><td>Fisher</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Хлорид магния</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4880</td><td>Коррозионный</td></tr><tr><td>термо научный пирс DNaseI</td><td>Fisher</td><td>PI-90083</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare&nbsp; Сефароза Быстрый Поток Катионный Обмен Медиа</td><td>Fisher</td><td>45-002-931</td><td></td></tr><tr><td>Трис-база</td><td>Fisher</td><td>BP152-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Азид натрия</td><td>TCI</td><td>S0489</td><td>Высокотоксичный</td></tr><tr><td>2-меркаптоэтанол</td><td>Fisher</td><td>ICN806443&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Сарториус&nbsp; Vivaspin 20 Центробежные концентраторы</td><td>Fisher</td><td>14-558-501</td><td></td></tr><tr><td>Моноосновной фосфат калия</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>2-гидроксиэтилдисульфид</td><td>Sigma Aldrich</td><td>380474</td><td></td></tr><tr><td>N-паратон;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-643</td><td></td></tr><tr><td>4 RC диализные мембранные трубки от 12 000 до 14 000 Dalton MWCO&nbsp;</td><td>Фишер</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CryoLoop</td><td>Hampton Research</td><td></td><td>криогенные трубки в форме петли</td></tr><tr><td>CryoTong</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>криогенный щипец</td></tr><tr><td>Cootg</td><td></td><td></td><td>Изображения электронной плотности генерируются программным обеспечением</td></tr></tbody></table>

Синтез 1,2-azaborines и подготовке их белковых комплексов с Т4 лизоцима Мутанты

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Мы описываем общий синтез 1,2-азаборинов с использованием стандартных безвоздушных методов и получения белкового комплекса с мутантами лизоцима Т4 путем диффузии пара. Чувствительные к кислороду и влаге соединения получают и изолируют в инертной атмосфере (N2) с помощью вакуумного газового коллектора или перчаточного ящика. В качестве примера синтеза азаборина мы демонстрируем синтез и очистку летучего N-H-B-этил-1,2-азаборина с помощью пятиступенчатой последовательности, включающей дистилляцию и колоночную хроматографию для выделения продуктов. Мутанты лизоцима T4 L99A и L99A/M102Q экспрессируются со штаммом Escherichia coli RR1. Стандартные протоколы химического лизиса клеток с последующей очисткой с помощью карбоксиметилионобменной колонки позволяют получить белок достаточно высокой чистоты для кристаллизации. Кристаллизацию белка проводят в различных концентрациях осадителя в различных диапазонах рН методом диффузии пара висячей каплей. Комплексное приготовление с малыми молекулами осуществляется методом диффузии пара в инертной атмосфере. Рентгеноструктурный анализ кристаллического комплекса дает однозначные структурные доказательства связывающих взаимодействий между сайтом связывания белка и 1,2-азаборинами.

Схематическое путь синтеза 1,2-azaborines показана на рисунке 1. Этот протокол применяется к синтезу пяти различных бор-азотсодержащих молекул. На рисунке 2 представлен 11 B ЯМР - спектров , измеренных в течение этапа 1.3 , чтобы контролировать образование целевого продукта (3). Очистку белка проводили с использованием системы хроматографии низкого давления и представитель хроматограмма показана на рисунке 3. ...

Представлен протокол синтеза 1,2-азаборинов и получения их белковых комплексов с мутантами лизоцима Т4.

Синтез 1,2-Azaborines и подготовке их белковых комплексов с Т4 лизоцима Мутанты

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Общая цель данного протокола заключается в описании общего метода синтеза 1, 2-азаборинов и возможности его применения в биомедицинских исследованиях. Основным преимуществом этого метода является обеспечение гарантированного синтеза соединений 1, 2-азаборина, которые представляют собой борсодержащие изостеры, сливающиеся с повсеместно встречающимся бензольным мотивом. Описанный предшественник может быть в дальнейшем функционализирован для получения потенциально более сложных молекул.Подготовка белковых комплексов с 1,2-азаборином позволит получить представление о будущем применении данного метода в биомедицинских исследованиях. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте продукт с замкнутым кольцом, как описано в текстовом протоколе. Добавьте 14 г палладия на угле к этому подготовленному продукту в толуоле.Затем извлеките колбу из контейнера. Установите на колбу высушенную в печи обратный холодильник 24/40, который был продут азотом и подключен к системе охлаждения водой. Поместите колбу в масляную баню и при перемешивании нагрейте реакционную смесь до интенсивного кипения при 135 °C.Проводите реакцию при кипении с обратным холодильником в течение 16 часов. После этого извлеките колбу из масляной бани, чтобы охладить реакционную смесь до комнатной температуры. После охлаждения замените обратный холодильник на септу в колбе для проведения реакции.С помощью шприца, оснащенного просушенной в печи иглой Luer Lock, отберите аликвоту объемом 5 мл. Перенесите аликвоту в ЯМР-пробирку с завинчивающейся крышкой. Проанализируйте образец методом ЯМР на ядрах бора-11.Если реакция прошла не полностью, перенесите колбу с реакционной смесью в перчаточный бокс. Затем добавьте еще три грамма палладия на угле. После этого извлеките колбу из перчаточного бокса.Установите на колбу обратный холодильник 24/40, предварительно продутый азотом и подключенный к системе охлаждения. Используя масляную баню, нагрейте реакционную смесь до интенсивного кипения при 135 градусах Цельсия при перемешивании в течение 24 часов. С помощью ЯМР на ядрах бора-11 проанализируйте еще одну аликвоту, чтобы убедиться в завершении реакции.После этого перенесите реакционную колбу обратно в перчаточный бокс. Пропустите реакционную смесь через колонку для флеш-хроматографии, заполненную бумажными салфетками. Затем соберите фильтрат в круглодонную колбу объемом один литр, оснащенную магнитным перемешивателем.Промойте колонку 50 миллилитрами толуола. Извлеките сосуд с фильтратом из перчаточного бокса и подключите его к вакуумному газовому манифольду, оснащенному линией подачи азота. Поместите под колбу водяную баню, а также сосуд Дьюара с жидким азотом для улавливания растворителя.Откройте клапан высокого вакуума, чтобы начать удаление всех летучих компонентов из фильтрата. Затем верните реакционную смесь в перчаточный бокс. Перенесите смесь в высушенную в oven 250 milliliter круглодонную колбу 24/40 с магнитной мешалкой.Промойте остатки реакционной смеси дихлорметаном и перенесите их в колбу. Закройте колбу септой. Переместите колбу из перчаточного бокса к вакуумному манифольду и подключите ее.Откройте клапан высокого вакуума, чтобы удалить остатки растворителя. Затем быстро снимите септу и с помощью ложечки-шпателя добавьте гидрид кальция. Подсоедините круглодонную колбу к дистилляционному аппарату, описанному в текстовом протоколе, и установите температуру масляной бани на 100 °C.После завершения перегонки удалите источник нагрева и охладите установку до комнатной температуры. Снова создайте давление в охлажденной установке с помощью азота и плотно закройте пробковый кран на колбе для хранения в безвоздушной среде. Перенесите выделенный продукт из колбы в виалу в перчаточном боксе, после чего поместите виалу в морозильную камеру перчаточного бокса.После очистки белка перенесите очищенный раствор в диализную трубку. Поместите диализную трубку в контейнер с четырехлитровым раствором 100 мМ фосфата натрия, 550 мМ хлорида натрия и 0,2% азида натрия. Перемешивайте в течение ночи при температуре 4 °C.На следующий день добавьте 2-меркаптоэтанол в диализованный образец так, чтобы конечная концентрация составила 5 мМ. Затем с помощью центрифужного концентратора доведите концентрацию раствора до 40 мг/мл. Центрифугируйте образец при 5 000 об/мин и 6 °C, после чего удалите любой выпавший осадок.Затем в 24-луночном планшете создайте различные условия с использованием резервуарного раствора, как описано в текстовом протоколе. Для обеспечения герметичности нанесите консистентную смазку на края каждой лунки. Смешайте 5 µL концентрированного раствора белка с 5 µL резервуарного раствора на силиконизированном предметном стекле.Поместите покровное стекло перевернутым образом над лунками, содержащими резервуарный раствор. Храните планшет при температуре 4 °C для роста кристаллов. С помощью петли из криогенной трубки перенесите выросшие кристаллы в микроцентрифужную пробирку объемом 6 мл.Добавьте 50 µL маточного раствора. Затем перенесите пробирку в перчаточный бокс. Перенесите 5 µL подготовленного азаборинового лиганда на внутреннюю сторону защелкивающейся крышки пробирки.Закройте пробирку крышкой и храните в холодильнике внутри перчаточного бокса от двух до семи дней для уравновешивания путем диффузии паров. После этого нанесите каплю N Paratone на предметное стекло. С помощью микропипетки перенесите кристалл на стекло.Затем с помощью петли из криогенной трубки захватите кристалл и перенесите его из водного раствора в N Paratone. Погрузите кристалл, защищенный N Paratone, в сосуд Дьюара с жидким азотом. С помощью криогенных щипцов закрепите мгновенно замороженный кристалл на петле.Затем проанализируйте собранные данные о кристаллах в соответствии с текстовым протоколом. В данной работе представлен модифицированный синтез 1,2-азаборинов, основанный на ранее описанных методах. Три-аллилборин используется для получения аддукта N-аллила NTBSB-аллилхлорида.Для синтеза NTBS BCl 1, 2-азаборина используется одностадийная двухэтапная последовательность, которая обеспечивает более высокий выход выделенного продукта по сравнению с предыдущими методами. Синтез N-H-B-этил-1, 2-азаборина осуществляется в два этапа с использованием этиллития вместо комплекса хрома, применявшегося в ранее описанных методах. Белок очищают с помощью системы низконапорной хроматографии.Хроматограмма, полученная при 280 нанометрах, показывает пик, соответствующий мутанту T4 лизоцима L99am102q. Затем белок кристаллизуют и создают с ним комплексы с лигандами. При выполнении этой процедуры важно помнить, что синтез азаборина требует использования безвоздушных условий, таких как перчаточный бокс и вакуумный газовый манифольд, для предотвращения разложения соединений.После своей разработки этот метод открыл путь к изучению уникальных химических и физических свойств азаборинов по сравнению с углеродными ароматическими соединениями в классических биологических карманах восстановления площади.

synthesis-12-azaborines-preparation-their-protein-complexes-with-t4

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Биохимия

Аденовирус частиц разработаны содержать либо неестественные аминокислоты azidohomoalanine аналог кислоты или азидо...

Chemoselective Модификация поверхности с помощью вирусного Bioorthogonal химии нажмите

Протокол для диастереоселективном подготовки в одном сосуде цис - N-TS-iodoaziridines описывается. Поколение diiodomethyllithium, дополнение к N-Ц альдиминов и циклизации амино ювелирного дийодид среднего и iodoaziridines демонстрируется. Также имеется протокол быстро и количественно оценить наиболее подходящий стационарной фазы для очистки с помощью хроматографии.

Синтез и очистка Iodoaziridines Вовлечение Количественный Выбор оптимального стационарной фазы для хроматографии

Здесь мы представляем протокол для сайт-специфического введения химических зондов во фрагмент антитела путем генетического включения аминокислоты, содержащей азид, и последующего связывания азида с химическим зондом с помощью стимулируемого штаммом азид-алкинового циклоприсоединения (SPAAC).

Эффективная и сайта специфических антител к Этикетировочное штаммом раскрученной азида-алкиновая циклоприсоединения

Бициклических aziridinium ионов, например 1-azoniabicyclo [4.1.0] Гептан tosylate были получены от 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl] азиридин, который был использован для подготовки замещенных пиперидинов и azepanes через регио - и stereospecific кольцо расширение с различными нуклеофилами. Это весьма эффективный протокол позволили нам подготовить различные azaheterocycles, включая натуральные продукты, такие как fagomine, аналог febrifugine и balanol.

Подготовка стабильной бициклических Aziridinium ионов и их кольцо открытие для синтеза Azaheterocycles

3-Aroyl-N-hydroxy-5-nitroindoles были синтезированы цикловдум 4-нитронитробензена с конъюгированным аклиноном терминала в одноступенчатой тепловой процедуре. Препарат нитросоарена и алкинона были надлежащим образом зарегистрированы и, соответственно, через процедуры окисления на соответствующем анилине и на алкинол.

Прямой, реджоселективный и атомно-экономический синтез 3-ауроилов-N-гидрокси-5-нитроиндолы цикловуда 4-нитронитрособензена с алкиноном

В этом исследовании мы получаем как энантиомеры азиридина-2-карбоксилата, которые используются в асимметричном синтезе алкалоидов, включая биемамид B и D, так и (-)-эпиалло-изомускарин.

Получение энантиопурных неактивированных азиридинов и синтез биемамида B, D и эпиалло-изомускарина

Этот протокол описывает, как выполнять маркировку белка клеточного типа с помощью азидонорлейцина (ANL) с использованием мышиной линии, экспрессирующей мутантную L274G-метионин-тРНК-синтетазу (MetRS*), и необходимые шаги для выделения меченых белков клеточного типа. Мы описываем два возможных пути введения ANL у живых мышей путем (1) питьевой воды и (2) внутрибрюшинных инъекций.

Очистка и идентификация специфических белков клеточного типа из сложных тканей с использованием мышиной линии мутантной метиониновой тРНК-синтетазы

Смежные бисазиридины, содержащие неактивированные и активированные азиридины, синтезировали асимметричными органокаталитическими азиридинами и затем подвергали хемоселективным реакциям открытия кольца в кислых или основных условиях. Неактивированное кольцо азиридина открывается с меньшим количеством реакционноспособных нуклеофилов в кислых условиях, тогда как активированное азиридиновое кольцо открывается с большим количеством реакционноспособных нуклеофилов в основных условиях.

Получение смежных бизазиридинов для региоселективных реакций открытия кольца

Этот протокол описывает метод производства и оценки антимикробной активности и цитотоксичности катионного пептида Mel4 и пептидного имита RK758. Интегрируя химический синтез, рекомбинантную экспрессию и стандартизированные функциональные анализы, он обеспечивает упрощённый рабочий процесс для производства и тестирования пептидов и маломолекулярных имитаторов.

Производство и тестирование антимикробных пептидов и их имитаций

Описываем процедуры получения и доставки микрокристаллов мембранного белка в липидной кубической фазе для серийной кристаллографии на рентгеновских лазерах на свободных электронах и синхротронных источниках. Эти протоколы также могут быть применены для включения и доставки растворимых белковых микрокристаллов, что приводит к значительному снижению расхода образцов по сравнению с инжекцией жидкости.

Подготовка и поставка белка микрокристаллов в липидной кубической фазе для последовательного фемтосекундного кристаллографии

Изучите синтез 1,2-азаборинов и подготовку их комплексов с мутантами Т4 лизоцима. Этот надёжный метод позволяет получать борсодержащие изостеры бензола для биомедицинских исследований.

Синтез 1,2-Azaborines и подготовке их белковых комплексов с Т4 лизоцима Мутанты

Больше видео