Name: Живой конфокальной визуализации Развития Arabidopsis Цветы (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Изучите метод живой конфокальной визуализации развивающихся цветков Arabidopsis thaliana. Этот протокол позволяет исследовать динамику формирования органов и стволовых клеток цветка в реальном времени.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Автор хотел бы поблагодарить проф Эллиот М. Мейерович за его поддержку, а также замечания по рукописи, а также Энн Лавануэй в Колледж Дартмут и д-р Андрес Кольясо на биологической визуализации Facility Калифорнийского технологического института за помощь в решении технических проблем, с живой конфокальной микроскопии. Работа Натанаел Прунет получает поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения через Грант R01 GM104244 к Эллиот M Майероуиц.

<ol><li>Prunet, N., Jack, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flower+Development+in+Arabidopsis%3A+There+Is+More+to+It+Than+Learning+Your+ABCs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs.</a> Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).</li>
<li>Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+regulatory+mechanisms+controlling+floral+organ+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development.</a> FEBS J. , (2016).</li>
<li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+auxin+transport+and+gene+expression+during+primordium+development+revealed+by+live+imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).</li>
<li>Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell+homeostasis+and+growth+dynamics+can+be+uncoupled+in+the+Arabidopsis+shoot+apex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex.</a> Science. 310 (5748), 663-667 (2005).</li>
<li>Yadav, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WUSCHEL+protein+movement+mediates+stem+cell+homeostasis+in+the+Arabidopsis+shoot+apex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Dev%22%5BJournal%5D)">WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex.</a> Genes & Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).</li>
<li>Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+reveals+oriented+cell+divisions+associated+with+morphogenesis+at+the+shoot+apex+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).</li>
<li>Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DORNROSCHEN-LIKE+expression+marks+Arabidopsis+floral+organ+founder+cells+and+precedes+auxin+response+maxima%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima.</a> Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).</li>
<li>Urbanus, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+localisation+patterns+of+MADS+domain+proteins+during+floral+development+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biol. 9, (2009).</li>
<li>Hong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+Cell+Growth+Yields+Reproducible+OrganDevelopment+through+Spatiotemporal+Averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging.</a> Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).</li>
<li>Roeder, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+in+the+control+of+cell+division+underlies+sepal+epidermal+patterning+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 8 (5), e1000367(2010).</li>
<li>Heisler, M. G., Ohno, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24395274">Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).</li>
<li>Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Lineage+Analysis+to+Study+Cell+Division+Orientation+in+the+Arabidopsis+Shoot+Meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem.</a> Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li>
<li>Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+imaging+of+Arabidopsis+flower+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds.</a> Dev. Biol. , (2016).</li>
<li>Fernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+plant+growth+in+4D%3A+robust+tissue+reconstruction+and+lineaging+at+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution.</a> Nat. Methods. , (2010).</li>
<li>Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+GFP%3A%3AcDNA+fusions+enable+visualization+of+subcellular+structures+in+cells+of+Arabidopsis+at+a+high+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).</li>
<li>Irish, V. F., Sussex, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+apetala-1+gene+during+Arabidopsis+floral+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development.</a> Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).</li>
<li>Vernoux, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+auxin+signalling+network+translates+dynamic+input+into+robust+patterning+at+the+shoot+apex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Systems+Biol%22%5BJournal%5D)">The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex.</a> Mol. Systems Biol. 7, 508(2011).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+plant+stem+cell+function+by+conserved+interacting+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators.</a> Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).</li>
<li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoGraphX%3A+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864(2015).</li>
<li>Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cell+shape+and+gene+expression+in+the+shoot+apical+meristem+using+MorphoGraphX%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX.</a> Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).</li>
</ol>

Автор не имеет ничего раскрывать.

Здесь мы приводим протокол для визуализации живых, развивающегося Arabidopsis бутонов с конфокальной микроскопией и водой погружной линзой. В то время как это может быть сделано либо в вертикальном положении или инвертированный микроскоп, то проще и быстрее использовать прежний. Также стоит отметить, что различные системы конфокальной существенно различаются с точки зрения скорости, чувствительности и способности разделять длины волн. Лучшая конфокальная микроскопы теперь позволяет получать изображения несколько различных каналов (например , GFP, YFP, DsRed и пропидийиодид; фигура 2G) в тех же образцах. Некоторые конфокальные микроскопы оснащены спектральным детектором, который может собрать флуоресценции от нескольких флуорофоров одновременно и отделить их потом. При использовании обычного детектора, однако, множество лазеров и фильтров должно быть использовано для возбуждения и отделить флуоресценции от различных флуорофоров. Некоторые флуорофоры имеют полностью отчетливые спектры излучения (например , CFPд YFP), и могут быть отображены одновременно. Другие флуорофоры имеют частично перекрывающиеся спектры излучения (например , GFP и YFP), и обычно должны быть отображены отдельно, что увеличивает время формирования изображения. Воображение близка флуорофора также часто требует ограничения, сколько спектра собирают для каждого канала, чтобы предотвратить флуоресценции от одного флуорофоры от утечки в другой канал. Это приводит к потере интенсивности собранного сигнала, который может быть компенсирован увеличением мощности лазера и усиление. Однако продолжительное время формирования изображения и увеличение мощности лазера может отбеливать и / или привести к повреждению образца. Увеличение мощности лазера и / или усиления может также увеличить фоновый шум. Оптимизация интенсивности сигнала, разрешение и времени съемки для каждого образца осуществляется через процесс проб и ошибок, и включает в себя постоянные компромиссы. Этот протокол объясняет, как выполнять живую конфокальную микроскопию цветочных почек, развивающиеся на флангах расчлененной верхушки побега. ЭтоМожно утверждать, что тот факт, что стрелять вершина не соединена с остальной частью растения и растет в среде, содержащей цитокинины могут повлиять на SAM и развитие цветка. Однако, эта среда была разработана эмпирически через процесс проб и ошибок , чтобы обеспечить расчлененный стрелять апикальной меристемы производят новые цветочные почки при нормальной plastochron, и что эти бутоны развиваются нормально 15. Точно так же, чашелистник рассечение не кажется, влияет на характер экспрессии генов или развитие остальной части цветка. Другие протоколы подробно , как выполнять живую конфокальную визуализацию SAM еще прикреплены к остальной части растений (например , ссылка 11). Такие протоколы могут быть адаптированы к, и предлагают полезную альтернативу для визуализации развития цветов, особенно при изучении процессов цитокинина связанных. Они представляют собой ряд недостатков, однако: стволовые удлиняются и изгибы, и изменяют ориентацию цветочных почек;го во время получения изображения всхода апекса, прикрепленный к остальной части растений хорошо работает с прямым микроскопом, это гораздо сложнее сделать это с помощью инвертированного микроскопа. Погружные линзы имеют лучшую числовую апертуру (NA) , чем «сухие» линзы (то есть линзы, которые отделенны от образца на воздухе), и , следовательно , обеспечивают более высокое разрешение образца, которое имеет решающее значение при использовании конфокальной микроскопии. Использование воды погружение линз, таким образом, обеспечивает гораздо лучше, чем NA сухой линзы, при предотвращении верхушки побега из дегидратации во время процесса формирования изображения. В то время как глицерин и масляные линзы имеют еще более высокий, чем NA воды линзы, они требуют использования покровного, что очень непрактично с образцом размера с верхушкой побега, который также продолжает расти в течение покадровых экспериментов. С учетом размеров образцов (в зависимости от цветочных этапов, стеки может быть более 150 мкм), также важно, чтобы использовать объектив с большим рабочим расстоянием, Как правило, мы используем 20 или 40X объектив с NA 1 и рабочим расстоянием 1,7-2,5 мм. Конфокальный микроскоп программное обеспечение предлагает несколько способов для визуализации данных конфокальной, в том числе трехмерных реконструкций (рис 2, B1, B2 и B4) и мнения среза (рис 2, B3). В то время как наиболее часто используемые трехмерные виды максимальные проекции интенсивности конфокальной Z-стеки (рис 2, B1 и B4), некоторые программы (например , ZEN и Imaris) открывается вид прозрачности , который отфильтровывает сигнал из более глубоких частей образец (рисунок 2, В2), которые могут быть полезны при взгляде на процессы , происходящие, или генов , выраженных в, эпидермальным слоем. Интенсивность сигнала может либо быть закодированы с помощью одного цвета (фиг.2, B1), используя пиксельный Intensity, или с использованием цветового кода (рисунок 2, B4). Живые изображения конфокальных предлагает не только ценное качественное понимание развития цветка, он также потенциально обеспечивает онтогенетику с богатством количественных данных. Различное программное обеспечение (например , Imaris, Fiji, МАРС-АЛТ, MorphographX 15, 20, 21) позволяет для количественного определения количества или объема клеток , экспрессирующих один или несколько репортеров, или уровень экспрессии репортера в разных клетках. Такое программное обеспечение может также использоваться для выполнения автоматической сегментации клеток, отслеживать клеточные клоны и количественного роста. Это различное программное обеспечение предлагает аналогичные инструменты, но и во многом отличается. МАРС-АЛТ и MorphoGraphX были разработаны специально для растений 15, 20, 21, в отличие от Imaris ай Fiji. MorphoGraphX ​​позволяет только для сегментации и анализа эпидермального слоя, в то время как Imaris и MARS-ALT позволяют сегментации и анализа всей выборки. Тем не менее, МАРС-ALT требует предварительных изображений одного и того же образец из трех различных углов 15, и Imaris требуется только один стек. Доступ к количественной информации имеет решающее значение для дальнейшего нашего понимания развития цветка.

Большая часть тела растений образует после зародыше из группы стволовых клеток, расположенных на или вблизи вершины - или апикальных меристем - побегов и корней. Все надземные структуры взрослых растений происходят из апикальной меристемы побега (SAM), который непрерывно производит боковые органы на флангах: листы в фазе вегетативной и цветочные меристемы (FMS) после перехода к репродуктивной фазе. Главы МИД, в свою очередь превратиться в цветы. В то время как Arabidopsis САМ производит органы боковой по одному за раз, в итерационном, спирали, Главы МИД производят четыре типа цветочных органов в течение четырех мутовках, в частично синхронным образом, с несколькими программами развития разгадке одновременно. Генетические сети , лежащие в основе спецификации идентичности различных цветочных органов были частично расшифрованы (обзоры, ссылки см 1, 2), но многие аспекты цветка developmeнт, например, цветочные позиционировании органа и определение границ между мутовками, по-прежнему плохо изучено. Ранние молекулярные генетические исследования развития растений в основном полагались на методы , такие , как гибридизация и репортеров ВСО для анализа экспрессии генов в. Хотя эти методы предоставили огромное количество информации и внесли большой вклад в наше понимание роста и развитие растений цветка, существует серьезные ограничения: они не имеют хорошее клеточное разрешение, не позволяют легко наблюдение паттерна экспрессии нескольких генов в том же образцы, и, что важно, может быть применен только к мертвым, фиксированных тканей. Последние достижения в области конфокальной микроскопии преодолеть эти ограничения, а также обеспечить онтогенетики с мощным инструментом для исследования процессов, лежащий морфогенеза растений. В частности, конфокальной микроскопии позволяет для наблюдения живых тканей и органов на протяжении всей их формирования, что сritical полностью понять квинтэссенцию динамического процесса, как развитие. Живые изображения конфокальных широко используются для анализа антенного роста растений и производства боковых органов со стороны SAM (например , ссылки 3, 4, 5, 6), но за исключением нескольких отчетов (например , ссылки 7, 8, 9, 10), он не был широко применяется для изучения развития цветка. Протоколы для живых конфокальной визуализации SAM доступны (например , ссылки 11, 12), а также обеспечить хорошую основу для того, как изображения развивающихся бутонов , которые окружают SAM. Тем не менее, цветочные почки изображения представлены конкретные задачи: например,цветочные почки быстро стать больше , чем САМ, а на этапе 4, чашелистики начать покрытие FM (этапы , как описано в ссылке 13), и регулировки яркости флуоресценции от нижележащих тканей (фиг.2А). Здесь мы приводим подробный протокол, объясняющие, как выполнять конфокальной микроскопии живой на развитие Arabidopsis бутонов, используя либо прямой или инвертированный микроскоп и водно-погружной объектив. Ранее мы опубликовали этот протокол в работе14.

<table><tbody><tr><td>Щипцы&nbsp;</td><td>Электронная микроскопия</td><td>Sciences 72701-D</td><td>Dumont Style 5 Inox, для рассечения вершины</td></tr><tr><td>Pin Vise</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13560</td><td>длина 80 см, для абляции чашелистика</td></tr><tr><td>Прямые иглы из нержавеющей стали&nbsp;</td><td>Тед Пелла, Инк.</td><td>13561-50</td><td>0,1 мм Диаметр, 1,2 см длиной, для абляции чашелистика</td></tr><tr><td>Круглые пластиковые коробки</td><td>Электронная микроскопия Sciences</td><td>64332</td><td>прозрачные, 6 см в диаметре, 2 см глубиной, для использования в качестве препарирующей посуды</td></tr><tr><td>Прямоугольные откидные коробки</td><td>Durphy Packaging Co.&nbsp;</td><td>DG-0730</td><td>прозрачный, 2-7/8" в длину, 2" в ширину, 1-1/4" глубиной, для использования в качестве посуды для визуализации с вертикальным микроскопом</td></tr><tr><td>Чашки для культуры тканей, полистирол, стерильный</td><td>VWR</td><td>25382-064</td><td>прозрачный, 3,5 см в диаметре, 1 см в глубину, для использования в качестве посуды для визуализации с инвертированным микроскопом</td></tr><tr><td>P10 и P1000 пипетки&nbsp;</td><td></td><td></td><td>с соответствующими фильтрующими наконечниками</td></tr><tr><td>Стереомикроскоп</td><td></td><td></td><td>с максимальным увеличением 80-90X</td></tr><tr><td>Лазерная абляционная система</td><td></td><td></td><td>для абляции чашелистика</td></tr><tr><td>Лазерная сканирующая конфокальная микроскопическая система</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 или 40X водопогружающая линза</td><td></td><td></td><td>с NA 1 и рабочим расстоянием 1,7-2,5 мм</td></tr><tr><td>Агароза</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Сахароза</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Мурашиге и Скуг, основная солевая смесь</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td>без витаминов</td></tr>, <tr><td>Мио-инозитол</td>, <td>Сигма-Олдрич</td><td>I7508</td>, <td>витамин</td></tr><tr><td>Никотиновая кислота</td><td>, Сигма-Олдрич</td><td>N0761</td>, <td>витамин</td></tr><tr><td>Пиридоксина гидрохлорид&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6280</td><td>витамин</td></tr><tr><td>тиамина гидрохлорид&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td>витамин</td></tr><tr><td>глицин</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790</td><td>витамин</td></tr><tr><td>N6-бензиладенин&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td>BAP, раствор цитокинина</td></tr><tr><td>Пропидиумия йодида</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 мг/мл раствор в воде, для окрашивания клеточных стенок</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td>разведенный в воде до 80&nbsp; &mu; г/мл, для окрашивания плазматических мембран</td></tr></tbody></table>

Живой конфокальной визуализации Развития arabidopsis Цветы

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Изучение роста и развития растений уже давно полагались на экспериментальных методов с использованием мертвых, неподвижных тканей и не имеющих надлежащего клеточное разрешение. Последние достижения в области конфокальной микроскопии, в сочетании с развитием многочисленных флуорофоров, преодолели эти проблемы и открыли возможность изучить экспрессию нескольких генов одновременно, с хорошим ячеистым разрешением, в живых образцах. Живые изображения конфокальных обеспечивают биолог растений с мощным инструментом для изучения развития, и широко используются для изучения роста корней и формирования органов боковых на флангах апикальной меристемы побега. Тем не менее, он не был широко применяется для изучения развития цветка, отчасти из-за проблемы, которые являются специфическими для визуализации цветов, такие, как чашелистики, которые растут над цветочной меристемой и отфильтровать флуоресценцию от нижележащих тканей. Здесь мы представляем подробный протокол для выполнения конфокальной микроскопии живой в прямом эфире, развитие арабаidopsis бутоны, используя либо прямой или инвертированный микроскоп.

На рисунке 2 представлены различные виды конфокальных Z-стеки живых арабидопсиса цветочных почек , экспрессирующих различные флуоресцентные репортерные гены, и окрашивали либо пропидия иодида (рисунок 2, А-С5 и С) или FM4-64 (рисунок 2, E1-F) , к обеспечить четкое клеточное разрешение. Большинство конфокальной системы позволяют для визуализации двух флуорофоров с непересекающихся спектров излучения , такие как GFP или YFP вместе с либо пропидия иодида или FM4-64 (Фигура 2А - 2F). Лучшие системы конфокальных также способны разделить несколько флуорофоров с частично перекрывающимися спектрами излучения в одних и тех же образцах, такие как GFP и YFP, и DsRed и пропидийиодид (рис 2G). Три примера покадровых экспериментов представлены на рисунке2 и показывают цветочные почки развиваются нормально после того, как чашелистник абляция была выполнена либо с системой лазерной абляции (фиг.2, С1-С5 и D1-D5) или вручную с пин-тиски и металлический штырь (Рисунок 2, Е1-Е2). Обратите внимание , что бутон цветка показан на рисунке 2, Е1-Е2 от сверхчеловека-1 мутантного растения, поэтому пестик зачатки не наблюдается в центре зародыша на стадии 7. лазерной абляции формирующегося чашелистника зачатков бутона показано на рисунке 2, С1-С5 предотвращает их от покрытия FM, который по- прежнему могут быть отображены на стадии 5 (фиг 2, С5). И наоборот, в случае бутона , показанный на рисунке 2, D1-D5, лазерная абляция только с задержкой роста чашелистиков, но в конечном счете , чашелистики выросли , чтобы покрыть большую часть FM на стадии 5 (фиг.2, D5 </сильный&gt;). Наоборот, если слишком много мощности лазера и жилого время используются во время лазерной абляции, повреждение распространяется на центральную часть цветка и влияет на его рост, а иногда приводит к последующей гибели всего бутон цветка. <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig2.jpg" /> Рисунок 2: Визуализация конфокальной Z-стеки живых бутонов. А и В2 вид прозрачности; B1 и B4-G является максимальной проекцией интенсивности; B3 является ортогональным вид среза. (А - Е2) цветы , экспрессирующие репортер Венера для гена APETALA3 (зеленый); клеточные стенки окрашивали пропидийиодидом (красный, за исключением B4, зеленый). (А) соцветие; Цифры указывают цветочные этапы; чашелистики в стадии 4 и 5 цветов отфильтровать флуоресценцию репортера Венеры, который обычно Foсреднеквадратичное кольцо. Обратите внимание, что некоторые бутоны появляются наклонены по сравнению с соцветием. (В1 - В4) Четыре различные виды одного и того же конфокальной Z-стек на стадии 5 бутон цветка: проекция максимальной интенсивности (B1 и В4) с интенсивностью сигнала Венеры кодированной с интенсивностью пикселей в зеленом цвете (B1) или с огнем цветовым кодом (В4; цветовой код показан в нижней части панели); вид прозрачности (В2) и ортогональная проекция среза (В3; ориентация XY, XZ и YZ ломтиков указываются в панели). (С1 - С5) 4-дневная покадровый индивидуального бутона от стадии 3 к стадии 5; лазерная абляция (отмечено в виде белых признаков) проводила на день 1 и день 3 было достаточно , чтобы предотвратить чашелистики от покрытия центра бутона на стадии 5. (D1 - D5) 4-дневной покадровой индивидуального бутон цветка из сценаОт 3 до стадии 5; лазерная абляция, проведенная на 1-е дня, 2 и 3 была недостаточна, чтобы предотвратить чашелистики от покрытия центра бутона цветка. (E1 - E2) Индивидуальный бутон после ручного удаления абаксиальных и адаксиальных чашелистиков (E1) и всех чашелистиков (E2); белые стрелки указывают на оставшиеся чашелистиков; белые звездочки указывают шрамы в результате удаления чашелистиков. (F) стадия 7 apetala1-1 цветка , экспрессирующие DR5-3xVenusN7 репортера 18 (зеленый); плазматические мембраны окрашивали FM4-64 (красный); синие стрелки указывают листовидные структуры, заменяющие чашелистиков и не покрывают бутон цветка. (G) Стадия 4 бутона цветка , выражающий флуоресцентный GFP репортер Dornröschen-LIKE 7 (зеленый), репортер Венера Супермена (красный) и репортер DsRed для CLAVATA3 19 (голубого цвета); ячейкиСтены были окрашены пропидийиодидом (серый). д: день; й: стадия. Шкала бар = 25 мкм; Шкала идентична B1, B2 и B4, в C1-C5, и в D1-D5. Эта цифра была изменена с 14 ссылки. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Живые изображения конфокальных обеспечивают биолог с мощным инструментом для изучения развития. Здесь мы представляем подробный протокол для живой конфокальной микроскопии развития Arabidopsis цветов.

Живой конфокальной визуализации Развития Arabidopsis Цветы

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Общая цель данной процедуры — подготовка соцветий Arabidopsis thaliana для визуализации живых развивающихся цветочных почек с помощью конфокального микроскопа. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области развития цветков, касающиеся формирования и расположения органов цветка, а также динамики стволовых клеток цветка. Основным преимуществом данной методики является возможность живой визуализации цветков в процессе их формирования, что имеет решающее значение для понимания этого по сути динамического процесса.Чтобы открыть цветочные почки для визуализации, с помощью пинцета удалите вторичные соцветия и старые цветочные почки из первичного соцветия. Затем с помощью пинцета проделайте вертикальное отверстие в агарозе в предметном стекле или чашке для препарирования. Теперь отрежьте последние 0,5 сантиметра соцветия и установите его вертикально в агароз так, чтобы оставшиеся цветочные почки находились над поверхностью агарозы.Наполните чашку стерильной деионизированной водой так, чтобы верхушка побега была полностью погружена, и с помощью пипетки на 1 000 мкл удалите пузырьки воздуха, скопившиеся вокруг верхушки побега. Затем поместите образец под стереомикроскоп. С помощью пинцета удалите из погруженного образца цветочные почки, которые не будут использоваться для визуализации.При достижении седьмой стадии развития цветочных почек удалите воду из диссекционного блюдца, снова поместите блюдце под микроскоп и завершите диссекцию. Затем верхушку можно поместить вертикально в среду в чашке для визуализации так, чтобы над поверхностью среды находились только апикальная меристема побега и окружающие её цветочные почки. Если окрашивание верхушки не проводится немедленно, используйте пипетку объемом 1 000 µL, чтобы добавить каплю воды к образцу для поддержания его гидратации.Для окрашивания цветочных почек сначала удалите воду с поверхности чашки для визуализации с помощью бумажной салфетки. Затем положите чашку на бок, чтобы слить оставшуюся воду с поверхности среды. Подождите одну минуту, после чего удалите скопившуюся воду новой салфеткой.Затем под микроскопом с помощью пипетки на 10 µL нанесите от 20 до 30 µL соответствующего красителя, стараясь полностью покрыть образец для обеспечения однородного окрашивания. По истечении необходимого времени инкубации промойте почки дважды стерильной деионизированной водой. Для получения изображений на инвертированном микроскопе используйте пипетку на 1 000 µL, чтобы поместить каплю стерильной деионизированной воды на кончик объектива.Затем переверните чашку для визуализации вверх дном, добавьте каплю стерильной деионизированной воды на диссецированную верхушку и поместите образец перевернутым образом на предметный столик микроскопа, стараясь не раздавить его. Используя контроллеры X, Y и Z, доведите диссецированную верхушку до контакта с каплей на кончике объектива. Образуется водяной столбик.Для получения изображений на вертикальном микроскопе наполните чашку для визуализации стерильной деионизированной водой так, чтобы поверхность среды и образцы были полностью погружены в слой воды толщиной от 2,5 до пяти миллиметров. Затем поместите чашку на предметный столик вертикального микроскопа и отрегулируйте положение погружного объектива так, чтобы его кончик погрузился в воду. После этого с помощью пипетки объемом 1 000 µL удалите любой пузырек воздуха, который мог скопиться на кончике объектива.Для любого типа микроскопа, после подготовки образца, используйте контроллеры X и Y, чтобы поместить один из препарированных апексов в поле зрения объектива, и контроллер Z для фокусировки на образце. После нахождения образца используйте программное обеспечение конфокального микроскопа, чтобы увеличить интересующий цветочный бутон и получить изображение. Установите параметры визуализации, определите верхнюю и нижнюю границы Z-стека, а затем приступайте к получению изображений цветочного бутона.Для лазерной абляции примордиев чашелистиков переключите путь луча на камеру, соединенную с системой лазерной абляции. Затем с помощью программного обеспечения системы лазерной абляции определите зону абляции. После этого установите мощность лазера и время выдержки на соответствующие параметры, чтобы уничтожить достаточное количество клеток, не нанося чрезмерных повреждений подлежащим тканям, и приступите к абляции.Если планируется проведение экспериментов с таймлапс-съемкой, слейте воду и накройте чашку, чтобы предотвратить дегидратацию между временными точками визуализации. Затем поместите образцы в соответствующие условия культивирования. Большинство конфокальных систем позволяют одновременно визуализировать два флуорофора с неперекрывающимися спектрами испускания, например, GFP или YFP совместно с провидиум йодидом или FM4-64.Лучшие конфокальные системы также способны разделять несколько флуорофоров с частично перекрывающимися спектрами испускания в одних и тех же образцах, таких как GFP или YFP, DsRed и пропидия иодид, что проиллюстрировано на данном репрезентативном изображении. Здесь представлены примеры экспериментов с таймлапс-съемкой бутонов цветка, которые развивались нормально после абляции чашелистиков с помощью системы лазерной абляции или вручную с использованием ручной дрели и металлической иглы. Лазерная абляция развивающихся примордиев чашелистиков этого цветочного бутона предотвратила их перекрытие цветочной меристемы, которую по-прежнему можно было визуализировать на пятой стадии.Напротив, в этом цветочном бутоне лазерная абляция лишь замедлила рост чашелистиков, хотя к пятой стадии они в итоге разрослись и закрыли большую часть меристемы цветка. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как подготовить Arabidopsis для конфокальной визуализации живых цветочных бутонов. Следуя этой процедуре, на основе полученных конфокальных изображений можно извлечь как качественные, так и количественные данные с помощью различных программ для анализа изображений.Данный метод поможет исследователям в области развития растений изучать динамику экспрессии генов, деления клеток и формирования органов в живых развивающихся цветках.

live-confocal-imaging-of-developing-arabidopsis-flowers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Биология развития

Мы описываем использование perfluorodecalin как инфильтративный монтажа среды. Это простой способ улучшения глубину изображения...

Простой метод для работы с изображениями Arabidopsis Листья Использование Perfluorodecalin как инфильтративный Средний изображений

Сотовые конкретного анализа<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Листья Использование флуоресценции клеток, активированных Сортировка

Мы описываем протокол, используя камеру слайды и средств массовой информации для иммобилизации завода семядоли для конфокальной микроскопии эпидермиса в течение нескольких дней развития, документирования устьичного дифференциации. Флуорофор-меченных белков можно проследить динамически выражения и внутриклеточной локализации, повышения понимания их возможной роли в процессе деления клеток и их тип дифференциации.

Долгосрочные, Высокое разрешение конфокальной микроскопии Lapse время<em&gt; Arabidopsis семядолей</em&gt; Эпидермиса во время прорастания

Сигнализации Ca 2 + регулирует разнообразные биологические процессы в растениях. Здесь мы представляем подходы для мониторинга абиотическую стресс, вызванный пространственная и временная Са 2 + сигналы в Arabidopsis клеток и тканей с использованием генетически закодированные Ca 2 + показатели экворин или Case12.

Измерение пространственных и временных Ca 2 + Сигналы в Arabidopsis растений

Мы приводим простой и универсальный способ выполнения флуоресцентные жить изображений Arabidopsis thaliana листьев в течение длительного периода времени. Мы используем трансгенных растений Arabidopsis выражая флуоресцентные Репортер ген под контролем промотора, связанных с иммунитетом в качестве примера для пространственно-временных понимания растений иммунных реакций.

Универсальный метод для монтажа Arabidopsis оставляет для прижизненной покадровой изображений

Этот протокол представляет как жить изображения и анализировать меристем апикальной стрелять из различных видов растений с помощью лазера, Сканирующая конфокальная микроскопия.

Конфокальный живых изображений меристем апикальной стрелять из различных видов растений

Здесь мы описываем протокол для живой клеточной визуализации цитоскелета корковых микротрубочек на съемках апического меристема и отслеживаем его реакцию на изменения в физических силах.

Live Cell Imaging микротрубочек цитоскелет и микромеханические манипуляции Arabidopsis стрелять Apical Meristem

Здесь мы описываем усовершенствование метода полу-in vitro (SIV) для наблюдения за наведением и приемом пыльцевой трубки у Arabidopsis thaliana, что повышает восприимчивость яйцеклеток. Высокопроизводительный метод SIV cum septum может быть связан с маркерными линиями гаметофитов и генетически кодируемыми биосенсорами для мониторинга динамического процесса оплодотворения.

Живая визуализация приема пыльцевой трубки Arabidopsis и двойного оплодотворения с использованием метода полу-in vitro cum septum

Движение хромосом во время мейотической профазы является плохо изученным явлением, которое имеет фундаментальное значение для образования спор. В этом протоколе описан метод получения, анализа и количественной оценки движений центромеры во время мейотической профазы в мужских мейоцитах Arabidopsis thaliana .

Визуализация движений центромеры во время мейотической профазы у самцов Arabidopsis thaliana

Этот протокол предлагает эффективный рабочий процесс для микроскопии с помощью локализации одной молекулы изолированных ядер Arabidopsis с использованием оптимизированной изоляции, фиксации и маркировки для достижения надёжной наномасштабной визуализации хроматина и РНК-полимеразы II. Этот подход легко адаптируется к другим белкам, ассоциируемым с хроматином, или к модификациям гистонов для высокоразрешающей визуализации.

Упрощённый протокол для одномолекулярной локализации микроскопии в ядрах арабидопсиса

Этот процесс использует конфокальную микроскопию в сочетании с флуоресцентно маркированной линией ядра и маркера хроматина у Arabidopsis thaliana для одновременной фиксации динамики ядра и хроматина в корнях Arabidopsis и изучения изменений этой динамики в ответ на факторы развития и окружающей среды.

Количественное изображение живой клетки формы ядра и динамики хроматина во время развития и воздействия стресса окружающей среды в корне Arabidopsis thaliana

Изучите метод живой конфокальной визуализации развивающихся цветков Arabidopsis thaliana. Этот протокол позволяет исследовать динамику формирования органов и стволовых клеток цветка в реальном времени.

Живой конфокальной визуализации Развития Arabidopsis Цветы

Больше видео