Форсколин-индуцированной Отек в кишечном органоидов: In Vitro Анализ для оценки ответа на наркотики в больных муковисцидозом

Общей целью этой процедуры является оценка индивидуальной функции CFTR в эффективности модулирующих CFTR методов лечения с использованием форсколин-индуцированного отека, или анализа FIS, в кишечных органоидах, полученных от пациентов с муковисцидозом. Этот метод решает ключевые вопросы в области муковисцидоза. В частности, это помогает идентифицировать пациентов, которые могут извлечь пользу из существующих или экспериментальных препаратов в долгосрочной перспективе.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что легкодоступная ткань может быть использована для получения органоидов от любого пациента с муковисцидозом, независимо от возраста. Применение этого метода распространяется на ортотерапию муковисцидоза и удовлетворяет насущную потребность в тестировании эффективности препарата экономически эффективным и индивидуальным способом. Демонстрировать процедуру будут Марвин Статия из Hubrecht Organoid Technology и Аннелот Вонк из группы Джеффри Бикмана.

Для получения оптимальных данных форсколин-индуцированного набухания необходимо работать с культурой, содержащей большие органоиды с множественными почками. После выявления такой культуры пометьте одну коническую пробирку объемом 15 миллилитров с названием образца и одну пробирку как промытую. Затем с помощью пипетки p1000 осторожно отсасывайте среду из лунок для культуры органоидов, не нарушая капли матрицы базальной мембраны.

И в каждую лунку добавляем по одному миллилитру прикорневой среды. Теперь с помощью пипетки разбить капли матрицы базальной мембраны в каждой лунке, а полученные органоидные суспензии перенести в 15-миллилитровую пробирку с названием образца. Промойте каждую лунку еще одним миллиметром базальной среды и вытяните смывки в пробирку для образца.

Когда все образцы будут собраны, заполните пробирку с образцами до конечного объема 12 миллилитров базальной средой и используйте предварительно смоченную пятимиллилитровую пипетку для смешивания раствора. Далее центрируйте органоиды, повторно суспендируя гранулы в одном миллилитре свежей базальной среды. Накройте тот же наконечник для пипетки p1000 наконечником p10 без фильтра и попробуйте оценить суспензию 20 раз.

Затем выбросьте оба наконечника и с помощью пятимиллилитровой пипетки добавьте в образец четыре миллилитра свежей базальной среды. Наклоните трубку примерно на 70 градусов и энергично перемешайте раствор два-три раза с помощью нового предварительно увлажненного наконечника для пипетки p1000. Удерживайте трубку в наклонном положении в течение 10 секунд.

Затем с помощью той же пипетки p1000 переложите верхний один миллилитр образца в промытые пробирки четыре раза. После того, как будет собран последний образец, соберите органоиды центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в 120 микролитрах 50% матрицы базальной мембраны. Затем поместите каплю объемом три микролитра на предметное стекло микроскопа и подтвердите наличие в капле не менее 30-50 органоидов под световым микроскопом.

Затем поместите три микролитровые капли ораганоида на середину каждой лунки 96-луночного планшета и поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 15 минут, чтобы матрица базальной мембраны затвердела. Затем добавьте либо 100 микролитров полной толстой кишки плюс VX809, либо одну полную толстую среду в соответствующие органоидные лунки и верните планшет в инкубатор на 18-24 часа. На следующий день с помощью пипетки-репитера добавьте 10 микролитров раствора кальция в каждую лунку, повторно суспензируя лунки один раз многоканальной пипеткой, чтобы убедиться, что они смешиваются, и верните тарелку в инкубатор еще на 30 минут.

Во время окрашивания клеток настройте инструмент визуализации в реальном времени на конфокальный микроскоп для визуализации живых клеток на 37 градусов и пять процентов углекислого газа для предварительной инкубации камеры визуализации. В конце инкубации перенесите планшет в держатель пластины на конфокальном микроскопе и используйте опцию умной настройки, чтобы выбрать дорожку Alexa floor 488. Затем установите пять экс-линз и область сканирования на 0,6x, чтобы уменьшить масштаб и захватить всю лунку.

Отрегулируйте мощность лазера и чувствительность детектора, чтобы обеспечить оптимальное обнаружение органоидов с кальциевым зеленым цветом на фоне. Установите битовую глубину на восемь, а размер кадра на 512 на 512 пикселей. Используйте параметр временных рядов, чтобы задать время, частоту и интервалы измерений.

А также опция плитки для ручного определения положения отдельных скважин. Теперь добавьте 100 микролитров свежеприготовленного форсколина и/или VX770 в соответствующие лунки, начиная с первой лунки, которую нужно изобразить, и начните измерение. Из-за дисфункции трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза, или CFTR, большинство органоидов муковисцидоза толстой кишки имеют компактные размеры и либо не набухают, либо демонстрируют очень небольшой отек через 60 минут после стимуляции форсколином, в зависимости от их генотипа.

Однако, когда органоиды муковисцидоза обрабатываются модуляторами CFTR перед стимуляцией форсколина, органоиды демонстрируют увеличение набухания. Чтобы количественно оценить набухание, можно измерить общую площадь поверхности кальциевого зеленого цвета в каждый момент времени. После освоения эти техники могут быть завершены за три или четыре часа, если они выполнены правильно.

Прежде чем приступить к этой процедуре, наиболее важным шагом является оптимизация условий культивирования кишечных органоидов, поскольку хорошее качество культур определит оптимальную производительность анализа FIS. После просмотра этого видео у вас будет хорошее понимание того, как работать с культурами кишечных органоидов и впоследствии измерять активность CFTR и реакцию модуляторов CFDR с помощью форсколин-индуцированного анализа набухания.