Одновременное измерение митохондриальной кальция и митохондриальной мембраны Потенциал в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы предоставить простой метод одновременного измерения поглощения митохондриального кальция и потенциала митохондриальной мембраны в живых клетках с помощью конфокальной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области митохондрий, например, как митохондрии действуют как локальные запасы кальция, жестко регулируя внутриклеточную концентрацию кальция. Основное преимущество этого метода заключается в том, что как митохондриальный кальций, так и потенциал митохондриальной мембраны могут быть измерены одновременно в клетках жизни без необходимости генетических манипуляций.

Хотя этот метод может дать представление о регуляции кальция при патологии митохондриальных заболеваний, он также может быть использован для изучения других новых дегенеративных состояний, когда регуляция кальция в моче имеет решающее значение. В ходе этой процедуры клетки выращиваются на десятисантиметровых чашках для клеточных культур или колбах площадью 75 квадратных сантиметров в питательных средах при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Чтобы собрать клетки, удалите среду с помощью аспирации и промойте клетки пятью миллилитрами PBS.

После этого удалите PBS с помощью аспирации. Затем добавьте 1,5 миллилитра Трипсина ЭДТА, и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 2 минут. Далее аккуратно постучите по тарелке, чтобы удалить ячейки.

Ресуспендируйте их в пяти миллилитрах питательных сред. После этого посчитайте клетки с помощью гемоцитометра. За день до конфокальной визуализации обеспечьте слияние клеток с точностью от 60 до 70 процентов в чашках или камерных покровных листах.

Затем инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы позволить клеткам прикрепиться и восстановиться. В этой процедуре приготовьте раствор для окрашивания пластинок с TMRM, Fluo 4 AM и поверхностно-активным веществом. Удалите питательную среду и промойте клетки 100 микролитрами PBS.

Далее удаляют PBS и инкубируют клетки в 100 микролитрах раствора для окрашивания пластинки в течение 45 минут при комнатной температуре. После этого удалите раствор для окрашивания пластинки и промойте клетки в 100 микролитрах HBSS без кальция, чтобы удалить излишки Fluo 4 AM и TMRM. Затем приготовьте раствор для внутриклеточной визуализации с дигитонином, TMRM и тапсигаргином.

Затем удалите HPSS, не содержащий кальция, и добавьте 300 микролитров раствора для внутримышечной визуализации в клетки. Оставьте клетки для равновесия при комнатной температуре на десять минут перед визуализацией с добавлением хлорида кальция. Используйте малую мощность лазера (примерно 5 процентов), чтобы свести к минимуму любое фотоповреждение клеток.

Используйте настройку на микроскопе лазеров для спектров возбуждения и излучения TMRM и Fluo 4 AM. Используйте малую мощность лазера примерно в пять процентов с высоким коэффициентом усиления, чтобы свести к минимуму фотоповреждение клеток. Затем настройте микроскоп на сканирование изображений каждые двадцать пять секунд. Сканируйте ячейки в течение десяти минут, чтобы установить показания базовой линии для сигналов TMRM и Fluo 4.

Затем приостановите сканирование изображения и добавьте 3 микролитра 40 миллимолярного исходного раствора хлорида кальция непосредственно в клетки в 300 микролитров раствора для визуализации внутримышечного в/м. Аккуратно перемешайте пипеткой. При добавлении раствора кальция в клетки будьте осторожны, чтобы не перемещать чашку на предметном столике микроскопа.

Продолжайте сканирование изображения в течение примерно четырех минут. Затем повторяйте добавление хлорида кальция каждые четыре минуты до тех пор, пока не будут достигнуты желаемые сигналы TMRM или Fluo 4, обычно около восьми-десяти добавлений. Затем добавьте разведение от 1 до 100 одного миллимолярного FCCP непосредственно в клетки для рассеивания потенциала внутренней мембраны.

Затем визуализируйте клетки в течение еще пяти минут до окончания эксперимента. После завершения визуализации определите интенсивность сигналов Fluo 4 и TMRM с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Для этого откройте изображение, нажмите на инструмент выделения и выберите интересующую область, содержащую митохондрии.

Несколько областей интереса можно выбрать для измерения, открыв Анализ, Инструменты, Менеджер ROI. Нажмите кнопку Добавить, чтобы включить выбранный ROI для измерения интенсивности. Повторяйте предыдущие шаги, пока все ROI не будут добавлены в менеджер ROI.

Измерьте среднюю интенсивность флуоресценции сигналов TMRM и Fluo 4 для каждой интересующей области, выбрав функцию более множественного измерения. Убедитесь, что выбран параметр «Измерить все срезы», а параметр «Одна строка на срез» снят. Затем нажмите Okay, чтобы получить таблицу средней интенсивности флуоресценции сигналов TMRM и Fluo 4 для каждого ROI в каждый момент времени.

Затем объедините данные для вычисления средней интенсивности и стандартного отклонения для сигналов TMRM и Fluo 4. В этом эксперименте клетки 143B были предварительно загружены Fluo 4 AM и TMRM перед пермеабилизацией дигитонином. После каждого добавления хлорида кальция сигнал TMRM уменьшается по мере того, как приток ионов кальция в митохондрии рассеивает потенциал митохондриальной мембраны.

Небольшой мембранный потенциал проявляется после перехода проницаемости, так как добавление 10 микромолярного FCCP все еще вызывает коллапс мембранного потенциала. Здесь концентрация кальция в митохондриях, на которую указывает сигнал Fluo 4, начинает увеличиваться после второго добавления хлорида кальция, когда свободный кальций в среде достигает 0,32 микромоляра. Каждое последующее добавление хлорида кальция вызывало прогрессирующее увеличение митохондриального кальция.

Здесь представлены изображения одновременных измерений мембранного потенциала в митохондриальном кальции. Красный сигнал указывает на TMRM, а зеленый сигнал указывает на Fluo 4. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за два часа, если она выполнена правильно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерять уровень митохондриального кальция и потенциал митохондриальной мембраны одновременно с помощью конфокальной микроскопии с добавлением экзогенного кальция к проникающим клеткам. Не забывайте, что работа с FCCP и дигитонином может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение СИЗ.