Живая съемка Cell и 3D Анализ ангиотензина типа 1a Торговля в трансфицированных человеческих эмбриональных клеток почки с помощью конфокальной микроскопии

Общая цель данного эксперимента — получить количественные пространственные и временные доказательства колокализации рецепторов ангиотензина 1-го типа с лизосомами после воздействия ангиотензина II. Этот метод был разработан для выявления различий в субклеточной обработке рецепторов дикого типа и мутантных рецепторов во время процесса интернализации, который происходит в ответ на стимуляцию лигандом. Преимуществами данной методики являются визуализация живых клеток, что позволяет исключить артефакты, возникающие при использовании фиксированных и пермеабилизированных детергентом клеток, а также возможность оценки динамических изменений локализации рецепторов в режиме реального времени.

Начните с выбора подходящего объектива с числовой апертурой 1,4 и центрируйте его над предметным столиком микроскопа. Нанесите каплю иммерсионного масла с высокой вязкостью и низкой автофлуоресценцией на объектив, затем поместите камеру с трансфицированными клетками на предметный столик микроскопа. Осторожно поднимайте объектив, пока масло не коснется нижней части первого предметного стекла, и найдите тусклые клетки.

При наличии здоровой исследуемой клетки в центре поля зрения переключитесь в конфокальный режим и убедитесь, что клетка хорошо распластана, а ее вентральная сторона плотно прилегает к покровному стеклу. Откройте диалоговое окно Z Stack, нажмите Live, сфокусируйтесь на верхней части клетки, а затем нажмите Begin. Затем сфокусируйтесь на нижней части клетки, введите размер шага по Z 1.00 micrometer и нажмите End.

Затем в настройках сбора данных (Acquisition settings) в верхней части экрана выберите режим XYZT. В завершение установите временной интервал сканирования и общую продолжительность сканирования, чтобы наблюдать за направлением рецепторов ангиотензина 1A типа, меченных GFP, к лизосомам. После этого, чтобы начать стимуляцию лигандом, добавьте три микролитра 100-кратного стокового раствора лиганда в лунку, в которой проводится визуализация, и нажмите «Start», чтобы зафиксировать ответ в 3D с заданной периодичностью и в течение необходимого времени.

Для анализа изображений живых клеток откройте соответствующее программное обеспечение для количественного анализа 3D-изображений. В данном протоколе используется Velocity. Щелкните правой кнопкой мыши в поле изображения и выберите Properties (Свойства).

Введите соответствующие значения пикселей изображения по осям XY и Z для создания измерительной последовательности с целью анализа интенсивности свечения везикул рецепторов, меченных GFP, и всей клетки в ответ на обработку лигандом. В меню 2D выберите режим расширенного фокуса (extended focus) для наблюдения за клеткой. Затем с помощью инструмента произвольной области (freestyle region tool) выделите область интереса вокруг клетки, после чего щелкните правой кнопкой мыши по изображению и выберите «Обрезать по выделению» (Crop to Selection).

Будет создан новый объект изображения. Нажмите на название изображения, чтобы выбрать обрезанное изображение клетки и открыть вкладку измерений. Чтобы измерить экспрессию GFP в интернализованных везикулах, перетащите функцию Find Objects из раздела Finding в окно последовательности выше.

Установите канал поиска объектов на GFP и откройте значок настроек, чтобы установить порог по стандартному отклонению, а нижний предел — на шесть, для выбора объектов с наибольшей интенсивностью GFP. Установите минимальный размер объекта на 0 µm³. Затем нажмите «measure» и выберите каналы и типы измерений.

Чтобы определить порог и фильтры для идентификации всей клетки и измерения общей интенсивности GFP, перетащите второй блок Find Objects. Затем установите канал Find Objects на GFP, а стандартное отклонение — на ноль, чтобы выбрать объекты с любой интенсивностью GFP, и установите минимальный размер объекта на 2 µm³. Перетащите Filter Population в блок Find Objects для Population two и выберите объем в µm³ более 100, чтобы выделить всю клетку и исключить все более мелкие объекты.

Затем выберите вкладку «measurements» (измерения) и пункт «Make Measurement», чтобы выполнить измерения во всех временных точках. Чтобы проанализировать измеренную экспрессию GFP в везикулах и во всей клетке с течением времени, нажмите на имя файла с данными измерений под названием изображения. Чтобы извлечь данные по GFP и везикулам из общего массива данных, откройте вкладку «raw» (исходные данные) и выберите первую популяцию («population one»).

Затем откройте вкладку анализа, нажмите правой кнопкой мыши на данные, выберите «Analysis», а затем «Restrict Analysis», чтобы выбрать популяцию один. Для измерения количества GFP во всей клетке переключите оба параметра на популяцию два. В разделах «Analyze These Data» и «Summarized By» выберите «sum GFP color channel» и «sum».

Затем в разделе Organize the data by (Организовать данные по) в поле row (строка) выберите time point (временная точка). Чтобы извлечь данные о количестве GFP в лизосомах, в разделе Find Objects (Поиск объектов) для первой популяции установите find objects channel (канал поиска объектов) на красный канал. В окне диалога, нажав на иконку колеса, установите параметр threshold using (порог по) на standard deviation (стандартное отклонение), нижний предел — на шесть, чтобы выбрать красные объекты с наибольшей интенсивностью, а minimum object size (минимальный размер объекта) — на 0,017 µm³.

Выберите параметры измерения и создайте элемент измерения, чтобы проводить замеры во всех временных точках. Для анализа экспрессии GFP в лизосомах нажмите на имя файла элемента измерения под названием изображения. Выберите «population one» на вкладке «raw», затем выберите «population one», «sum GFP color channel» и «sum» на вкладке «analyze», снова щелкнув правой кнопкой мыши, чтобы измерить количество GFP в красных везикулах.

До стимуляции лигандом рецепторы ангиотензина 1А типа, меченные GFP, локализованы преимущественно в плазматической мембране. Однако в течение 2,5 минут после добавления ангиотензина II эти рецепторы интернализуются, образуя яркие везикулы, которые впоследствии агрегируют в крупные парануклеарные везикулы.

Фильтрация по размеру не позволяет разграничить более крупные оборку и кластеры везикул, однако показывает, что количество GFP в объектах меньшего размера увеличивается быстрее, чем в объектах большего размера. На этом репрезентативном графике временного хода экспрессии GFP без использования автофокусировки уровень интернализованного GFP измерялся как процент от общего количества клеточного GFP. Анализ общего содержания GFP в клетке показал, что в данной клетке не происходило значительного фотовыгорания с течением времени.

Количественное определение GFP в лизосомах трансцитированных клеток также показывает, что интенсивность рецептора ангиотензина 1A-типа в лизосомах не изменяется в течение 24 минут после введения ангиотензина II. В ходе данной процедуры важно контролировать жизнеспособность клеток до и во время визуализации; поскольку процедура занимает много времени, эксперимент следует прекратить, если клеточные культуры имеют какие-либо отклонения. После завершения данной процедуры для обнаружения и подтверждения субклеточной локализации рецепторов можно использовать иммуноокрашивание, FRET или FLIM.

Для определения идентичности и анализа изменений сигнальных молекул, участвующих в трафике рецепторов, можно использовать вестерн-блоттинг. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как проводить визуализацию живых клеток и последующий анализ для измерения индуцированного лигандом перемещения трансмембранных рецепторов в лизосомы, а также в другие субклеточные компартменты.