Целенаправленное плазматической мембраны Поставка гидрофобной Cargo инкапсулированы в жидком кристалле наночастицы Carrier

Общая цель данной экспериментальной процедуры заключается в использовании наночастицы на основе жидких кристаллов в качестве платформы для контролируемой доставки гидрофобного груза в липофильную часть плазматической мембраны живых клеток млекопитающих. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области доставки лекарств, например, о том, как эффективно обеспечить доставку и клеточный захват плохо растворимых в воде гидрофобных грузов. Основным преимуществом данной методики является возможность более специфической доставки мембранно-таргетных гидрофобных грузов к плазматической мембране в сочетании со снижением их цитотоксичности.

Процедуру продемонстрирует доктор Охил Наг, постдок из моей лаборатории. Начните выполнение данной процедуры с приготовления жидкокристаллических наночастиц DiO, как описано в текстовом протоколе. Затем добавьте 20 µL свежеприготовленного рабочего раствора NHSS/EDC к 1.0 mL жидкокристаллических наночастиц DiO в буфере HEPES.

Перемешивайте в течение пяти минут. Затем добавьте к этой смеси 20 µL основного раствора холестерил-ПЭГ-амина и перемешивайте в течение двух часов. По истечении двух часов подвергните реакционную смесь кратковременному центрифугированию на максимальной скорости в течение 30 секунд с помощью настольной мини-центрифуги.

Затем пропустите супернатант через колонку для эксклюзионной хроматографии PD 10, уравновешенную фосфатно-солевым буфером Дульбекко. Чтобы подтвердить успешную ковалентную конъюгацию ПЭГ-холестерина с поверхностью жидкокристаллической наночастицы DiO с помощью гель-электрофореза, приготовьте агарозный гель согласно текстовому протоколу. После затвердевания геля добавьте достаточное количество электрофоретического буфера TBE, чтобы полностью погрузить гель в камере.

Затем добавьте в лунки геля по 35 µL образца наночастиц жидкого кристалла DiO и проведите электрофорез в течение 20 минут при напряжении 110 V. Визуализируйте гель с помощью системы имиджинга гелей, используя возбуждающий фильтр с длиной волны 488 нм и эмиссионные фильтры в диапазоне от 500 до 550 нм. Подготовьте чашки для культивирования тканей диаметром 35 мм с вставками из покровных стекол номер один диаметром 14 мм, предварительно обработав их бычьим фибронектином в DPBS в течение двух часов при 37 °C.

Через два часа удалите раствор фибронектина из культуральной чашки. Соберите клетки HEK 293 T17 из флакона T25, предварительно промыв монослой клеток тремя миллилитрами DPBS, а затем добавив два миллилитра трипсина ЭДТА. Инкубируйте флакон при 37 °C в течение примерно трех минут.

После того как клетки открепятся от стенки флакона, нейтрализуйте трипсин, добавив во флакон четыре миллилитра полной среды. Определите концентрацию клеток в суспензии с помощью счетчика клеток. Затем с помощью ростовой среды доведите концентрацию клеток примерно до 80 000 клеток на миллилитр.

Добавьте три миллилитра клеточной суспензии в чашку и культивируйте в инкубаторе в течение ночи. На следующий день клетки должны достичь примерно 70% конфлюэнтности и быть готовыми к использованию. Достаточная плотность клеток имеет решающее значение для надежного и эффективного мечения высокого процента клеток.

Приготовьте растворы DiO, жидкокристаллических наночастиц DiO и ПЭГ-холестериновых жидкокристаллических наночастиц DiO в объеме одного миллилитра в среде для доставки путем разведения соответствующих стоковых растворов. Удалите питательную среду из культуральных чашек с помощью серологической пипетки и дважды промойте монослои клеток раствором HEPES DMEM. Проводите промывку, осторожно добавляя HEPES DMEM к краю чашек с помощью пипетки, а затем удаляя его.

Добавьте 0,2 мл подготовленных растворов для доставки либо свободных DiO, либо жидкокристаллических наночастиц DiO в центр культуральных чашек. Затем верните чашки в инкубатор на соответствующий период времени. Более длительная инкубация приводит к неспецифическому клеточному мечению немембранных областей.

По окончании периода инкубации удалите растворы для доставки с помощью серологической пипетки. Промойте монослои клеток дважды с помощью DPBS, используя по 2 мл для каждой промывки. Зафиксируйте монослои клеток 4% параформальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре.

Удалите раствор параформальдегида с помощью пипетки и аккуратно промойте клетки один раз двумя миллилитрами DPBS. Теперь фиксированные клетки готовы к визуализации на наличие мембранного флуоресцентного сигнала с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. На предметном столике микроскопа, оснащенном камерой с подогревом, проведите съемку образца живых клеток с использованием конфокального микроскопа для оценки маркировки мембран.

Если визуализация не проводится немедленно, замените среду на DPBS, содержащий 0,05% азида натрия, и храните чашки при температуре four degrees Celsius. В данном методе клетки одновременно метят DiO в качестве донора FRET и DiI в качестве акцептора FRET. Последовательно пометьте клетки с помощью жидкокристаллических наночастиц DiO с ПЭГ-холестерином и свободным DiI, как описано ранее.

После окрашивания один раз промойте клетки двумя миллилитрами DPBS с помощью серологической пипетки и замените их двумя миллилитрами раствора для визуализации живых клеток. На предметном столике микроскопа, оснащенном камерой с подогревом, проведите визуализацию образца живых клеток с помощью конфокального микроскопа в режиме FRET-визуализации. Настройте эксперимент с интервалами в 30 минут в течение четырех часов, возбуждая донор DiO при 488 nanometers и регистрируя полные спектры эмиссии как донора DiO, так и акцептора DiI в диапазоне от 490 до 700 nanometers с использованием 32-канального спектрального детектора.

Затем определите интенсивность эмиссии с временным разрешением как для донора DiO, так и для акцептора DiI в клетках, окрашенных жидкокристаллическими наночастицами DiO с ПЭГ-холестерином и DiI. Наконец, рассчитайте отношение FRET донора и акцептора с временным разрешением для изображений, как описано в текстовом протоколе. Свободный DiO накапливается неспецифически внутри клеток, а не в плазматических мембранах клеток, которые были контр-окрашены двухмаркированным мембранным фосфолипидом.

Это можно визуализировать с помощью совмещенных изображений. И наоборот, жидкокристаллические наночастицы DiO с ПЭГ-холестерином специфически метят только плазматическую мембрану клетки, что подтверждается колокализацией с дважды меченным мембранным фосфолипидом. FRET подтверждает перераспределение DiO из жидкокристаллической наночастицы в липидный бислой мембраны, что проявляется в наблюдаемом увеличении переноса энергии от донора DiO к акцептору DiI.

FRET между DiO и DiI, а также изменения в эмиссии DiO и DiI подтверждают усиление FRET от DiO к DiI в зависимости от времени. Жидкокристаллические наночастицы DiO с ПЭГ-холестерином демонстрируют минимальную цитотоксичность при жизнеспособности 90%, по сравнению со значительной токсичностью свободного DiO при жизнеспособности примерно 50%. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как синтезировать жидкокристаллические наночастицы с нагрузкой, проводить их биофункционализацию для клеточного таргетирования и визуализировать клетки с нагрузкой для подтверждения успешной доставки в клетки.

Как правило, люди, впервые использующие этот метод, сталкиваются с трудностями, поскольку специфическая доставка DiO из водного раствора в плазматическую мембрану представляет собой серьезную проблему. Идея этого метода возникла у нас после использования платформы на основе жидкокристаллических наночастиц для доставки противоракового препарата доксорубицина в клетки, когда мы заметили его способность модулировать кинетику клеточного захвата препарата. После освоения данной процедуры этот подход может быть применен для доставки в клетки широкого спектра гидрофобных грузов, транспортировка которых из водных сред в клетки представляет особую сложность.

Данный подход может быть использован для более эффективной доставки препаратов, нацеленных на мембраны, и биоактивных молекул, таких как вольтаже-чувствительные красители для визуализации мозга или фотодинамические препараты для фотонно-ассистированной терапии.