Подготовка и оценка ^99m Tc меченных тридентатной хелатов для предварительной ориентации Использование биоортогональные реакции

Общая цель этой процедуры заключается в получении меченых технецием-99m тетразинов для предварительной таргетной визуализации с использованием биоортогональной химии с модифицированными трансциклооктенами биомолекулами в качестве векторов-мишеней. Этот метод обеспечивает важную новую платформу для разработки новых радиофармацевтических препаратов. Благодаря предварительному нацеливанию описанные здесь комплексы технеция могут быть использованы для визуализации широкого спектра органов, тканей и биомаркеров.

Этот метод является преимуществом, поскольку он обеспечивает надежный пошаговый метод получения тетразин, меченных радиоактивными метками технеция-99m, наиболее широко используемого медицинского изотопа в диагностической медицине. Этот метод можно использовать с различными векторами наведения, включая малые молекулы и антитела. Его также можно использовать для лучевой терапии путем замены технеция на бета-излучающие изотопы рения.

Часть процедур на животных будет демонстрировать Нэнси Янзен, техник-биолог в нашей лаборатории. Чтобы начать процедуру радиоактивного мечения, в микроволновом флаконе смешайте восемь миллиграммов боранокабоната калия, 15 миллиграммов карбоната натрия, 20 миллиграммов декагидрата тетрабората натрия и 25 миллиграммов тетрагидрата тартрата калия натрия. Продуйте флакон газообразным аргоном в течение 10 минут.

Затем добавьте во флакон четыре миллилитра технеция-99m пертехнетата в 0,9% физиологическом растворе с активностью 1,110 мегабеккерелей. Загрузите реакционную смесь в микроволновый реактор и помешивайте в течение 10 секунд. Затем нагрейте смесь до 110 градусов Цельсия в течение 3,5 минут, чтобы получить катион трикарбонильного технеция-99m.

Добавьте около 400 микролитров одного моляра соляной кислоты, чтобы довести pH раствора до 3,5 к четырем. Далее для каждого тетразинового лиганда растворите два миллиграмма лиганда в 250 микролитрах метанола. Добавьте в каждый раствор лиганда по 250 микролитров комплекса технеций-99m с активностью 74 мегабеккереля.

Нагрейте смесь в микроволновом реакторе при температуре 60 градусов Цельсия в течение 20 минут. Для тетразиновых лигандов с протекторными группами t-бутила переложите раствор из микроволнового флакона в 20-миллилитровый сцинтилляционный флакон, а затем выпарите растворитель и повторно растворите каждый комплекс в одном миллилитре раствора дихлорметана и трифторуксусной кислоты в соотношении один к одному по объему. Затем переложите раствор в микроволновый флакон и нагрейте эти комплексы в микроволновом реакторе при температуре 60 градусов Цельсия в течение 6-10 минут, чтобы снять защиту с лигандов.

Охладите комплексы до комнатной температуры, а затем испарите растворитель. Повторно растворите остатки в 500 микролитрах водного раствора ацетонитрила или метанола в соотношении один к одному и воде перед тем, как приступить к очистке ВЭЖХ. Используйте ВЭЖХ с обращенной фазой C18 для очистки каждого меченого радиоактивным тетразиновым комплексом с градиентом элюирования от 30 до 70 до 40 до 60 ацетонитрила до воды в течение 20 минут с 0,1% трифторуксусной кислотой, присутствующей в элюенте по всей длине.

Соберите очищенный продукт, когда он ускользает от гамма-следа. Затем в воду вводят каждый меченый комплекс с раствором 0,125 мг соответствующего комплекса радий-тетразин в 20% метанола. Сравните время удержания пика комплекса рения в УФ-трассировке и пика комплекса технеция в кривой гамма-излучения, чтобы проверить идентичность пика гамма-излучения.

Удалите растворитель из каждого очищенного комплекса технеций-тетразин. Составьте каждый комплекс в концентрации 7,4 килобеккерелей на микролитр в фосфатно-солевом буфере с 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,01% полисорбата 80. Для каждой мыши наберите в шприц по 100 микролитров пяти микрограмм на микролитр раствора производного TCOPB в физрастворе, чтобы приготовить дозу 20 миллиграмм на килограмм

Подсоедините иглу 30-го калибра к шприцу-дозатору. Поместите мышь в физическое удерживающее устройство. Определите прожилки на боковой поверхности хвоста примерно в двух сантиметрах от конца хвоста, и протрите эту область спиртовым тампоном.

Введите иглу шприца под небольшим углом параллельно вене. Медленно вводите производное TCOBP. Извлеките иглу и приложите чистую марлевую губку с небольшим нажимом к месту инъекции до остановки кровотечения.

Через час после введения производного TCOBP введите 100-микролитровую дозу желаемого комплекса тетразина технеция-99m с активностью примерно 0,74 мегабеккереля путем введения в хвостовую вену. Используйте калибратор дозы для измерения активности 100-микролитрового тестового образца технециевого комплекса в момент введения. Сохраните тестовый образец для последующих измерений.

Обезболите мышь смесью 3% изофлурана и 2% кислорода через шесть часов после инъекции. Положите мышь на спину носом в носовой конус для продолжения анестезии и найдите мечевидный отросток. Подсоедините иглу 25 калибра к шприцу, предварительно обработанному гепарином.

Введите иглу под углом 20 градусов под мечевидный отросток, немного левее средней линии. После того, как игла будет полностью введена, медленно извлеките поршень, чтобы проверить наличие крови в ступице иглы, подтвердив успешную пункцию сердца. При необходимости отрегулируйте иглу.

После того, как сердце было проколото, медленно наберите в шприц один миллилитр крови. Переложите образец крови в предварительно взвешенную счетную пробирку. Усыпите мышь при вывихе шейки матки под наркозом.

Поместите усыпленное животное в полиэтиленовый пакет и измерьте активность всего организма с помощью калибратора дозы. Затем соберите коленные и плечевые кости, желчный пузырь, почки, печень, щитовидную железу и трахею, а также хвост. Вместе с их содержимым соберите желудок, тонкий кишечник, толстый кишечник и слепую кишку, а также мочевой пузырь.

Промойте кровь из всех собранных тканей, кроме желчного и мочевого пузырей, в фосфатно-солевом буфере. Промокните, высушите салфетки и поместите каждую салфетку в предварительно взвешенную счетную трубку. Измерьте остаточную активность туши.

Взвесьте каждый образец ткани и рассчитайте массу только ткани. Используйте мультидетекторный гамма-счетчик для измерения активности пятимикролитровой аликвоты исследуемого образца технециевого комплекса. Используя полученное значение в числах в минуту и измеренную активность в момент инъекции, рассчитать коэффициент пересчета.

Измерьте активность каждого образца ткани и жидкости с помощью гамма-детектора. Преобразуйте значения в микрокюри и нормализуйте каждое значение по массе органа, чтобы определить процент введенных доз на грамм ткани. Повторите этот процесс с дополнительными мышами без введения производного TCOPB в качестве отрицательного контрольного ряда.

С помощью этого метода пять комплексов тетразина, отличающихся комбинациями линкера и кей-лидера, были помечены технецием-99m. Производное TCOPB, которое локализуется в областях с высоким оборотом кальция в костях, было использовано для предварительного нацеливания на плечевые и коленные суставы мышей. Для каждого соединения тетразина рассчитывали соотношения процентной введенной дозы на грамм ткани для костей и крови.

Все пять соединений быстро очищали кровь и нацеливались на кость, что указывает на то, что селективная реакция биоортогонального связывания между соединениями тетразина и производным TCOBP происходила in vivo. Соединение три показало наилучшее сочетание целеуказания и очистки от крови. Отрицательные контрольные эксперименты показали, что меченые радиоактивными метками комплексы тетразина существенно не локализуются в кости в отсутствие производного TCOBP.

Например, когда производное TCOBP не вводилось, соединение 2 имело высокие уровни в желчном пузыре и кишечнике, но очень мало в костях. Среди пяти испытуемых соединений наблюдалась широкая вариабельность локализации тканей у мышей, получавших производное TCOBP. Например, очень мало соединения 3 было обнаружено в толстой кишке, печени, моче и мочевом пузыре по сравнению с другими комплексами, в то время как гораздо больше соединения 3 было обнаружено в костях.

Описанная здесь техника маркировки может быть выполнена от начала до конца менее чем за два часа при правильном выполнении. При использовании этого метода важно убедиться, что все реагенты точно взвешены, а соли продуваются аргоном перед добавлением в раствор технеция. Также важно, чтобы pH раствора технеция был отрегулирован до 3,5-4 перед добавлением тетразинового лиганда.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получать и очищать тетразины, меченные технецием, и как их можно использовать для создания новых радиофармацевтических препаратов с использованием предварительного нацеливания и биоортогональной химии. Не забывайте о соответствующих мерах предосторожности при работе с радиоактивными веществами, таких как понимание типа излучаемого излучения и того, как лучше всего экранировать образцы и обращаться с ними.