Простой эритроцит Лизис Метод создании B лимфобластоидная клеточных линий

Общая цель этого простого метода состоит в том, чтобы создать линии В-лимфобластоидных клеток, или В-ЛКЛ, с высокой эффективностью иммортизации, используя лишь небольшое количество крови и экономя время между инициацией и криоконсервацией. Это новый метод увековечивания В-клеток человека из цельной крови путем лизирования эритроцитов. B-LCL является ценным источником биоматериалов для проведения различных исследований.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что всего 0,5 миллилитров крови достаточно для получения B-LCL с эффективностью иммортализации и высокой жизнеспособностью клеток. Для создания B-LCL с помощью вируса Эпштейна-Барр, или ВЭБ, широко используемого метода трансформации В-лимфоцитов в отдельные мононуклеарные клетки периферической крови или PBMC, с помощью центрифугирования градиента плотности по Фиколлу. Однако, когда в образце содержится менее одного миллилитра лизиса эритроцитов, добавление не удастся.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы поняли, что выделить PBMC из маленьких эритроцитов с помощью метода разделения по градиенту плотности сложно. Чтобы получить ВЭБ, в первый день начните с размораживания клеток B95-8 и культивируйте их в культуральной колбе T25 в шести миллилитрах полной среды RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, двух миллимоляров L-глутамина и антибиотиков. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе.

На второй день под микроскопом понаблюдайте за морфологией клеток. Клетки находятся в хорошем состоянии, когда они яркие и круглые. Добавьте в культуру 10 миллилитров полного RPMI 1640 Medium.

На четвертый день добавьте 10 миллилитров свежей среды и перенесите клетки в колбу для культуры Т75. Затем, на восьмой день, добавьте еще 20 миллилитров среды и поддерживайте клетки в течение восьми дней без добавления свежей среды. На 16 день проверьте клетки под микроскопом.

Затем собирают 12 миллилитров клеток в центрифужные пробирки объемом 15 миллилитров. Затем криоконсервируйте клетки при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение одного часа и быстро разморозьте культуры при температуре 37 градусов Цельсия. Повторите замораживание размораживания, еще три раза, пока вирусные частицы не выйдут из клеток.

Центрифугируйте культуры при 240 раз g при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 0,22 мкм. Внесите 12 миллилитров фильтрата на пробирку и храните пробирки при температуре минус 80 градусов Цельсия.

В пробирку объемом 50 миллилитров добавьте 0,5 миллилитра цельной крови, которая была антикоагулянтирована ЭДТА К2. Добавьте один миллилитр буфера для лизиса эритроцитов в цельную кровь и хорошо перемешайте. Выдержать смесь при комнатной температуре в течение четырех минут. Затем быстро добавьте пять-семь миллилитров 1x PBS, чтобы остановить реакцию лизиса.

После добавления в кровь буфера для лизиса эритроцитов обязательно хорошо перемешайте. Инвертация обеспечивает своевременное завершение реакции. Далее центрифугируйте пробирку при 240 умноженных на г при комнатной температуре в течение пяти минут.

Белые кровяные тельца будут осаждаться на дне пробирки. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте осадок, добавив семь миллилитров 1640 Basic Medium. Затем центрифугируйте раствор перед повторением промывки.

С помощью 300 микролитров трансформационной среды повторно суспендируйте клеточную гранулу. Затем для проведения ВЭБ-инфекции добавьте в клеточную суспензию 60 микролитров 20 микрограмм на миллилитр циклоспорина А. Быстро разморозьте аликвоту ВЭБ при 37 градусах Цельсия и добавьте в клетки 240 микролитров вируса.

Тщательно перемешайте суспензию и переложите 200 микролитров на лунку в 96-луночную пластину. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. В течение первого месяца после инфицирования ВЭБ меняйте половину среды в клеточной культуре один раз в неделю.

На седьмой день под микроскопом виден только толстый слой фрагментов клеток. Через месяц после заражения скопления лимфобластоидных клеток видны под толстым слоем фрагментов клеток. С этого момента меняйте половину среды каждые три дня до тех пор, пока кластеры клеток не станут четко видны под микроскопом.

После повторной суспензии ячеек перенесите суспензию в лунки 24-луночной пластины. Затем, в зависимости от скорости роста клеток, когда питательная среда становится желтой, удваивается объем полной среды RPMI 1640. Когда кластеры лимфобластоидных клеток видны невооруженным глазом, перенесите культуру в колбу для культур Т25.

По мере того, как питательная среда становится желтой, удваивайте объем среды, пока объем не увеличится до 10-15 миллилитров. Перед заморозкой смените среду за 24 часа до закладки. Затем, чтобы заморозить клетки, центрифугируйте клеточную суспензию и используйте счетчик клеток для подсчета клеток.

С помощью замороженного исходного раствора, содержащего 90% FBS и 10% ДМСО, отрегулируйте суспензию до плотности от пяти до 10 умножить на 10 до шестой клетки на миллилитр. Затем заморозьте суспензию со скоростью от одного градуса Цельсия в минуту до минус 80 градусов Цельсия перед переносом замороженных клеток непосредственно в жидкий азот. В процессе трансформации морфологические изменения клеток видны с помощью световой микроскопии.

Через семь дней после заражения небольшие кластеры клеток хорошо видны при использовании метода разделения по градиенту плотности, в то время как при методе лизиса эритроцитов виден только толстый слой фрагментов клеток. Через 30 дней после заражения кластеры лимфообластидных клеток видны под толстым слоем фрагментов клеток. При более частой смене среды клеточный мусор уменьшается, а клеточные кластеры становятся хорошо видимыми и похожими на культуру, полученную путем разделения градиента плотности.

Наконец, для оценки жизнеспособности B-LCL был использован анализ MTT. Показанные здесь результаты указывают на то, что клетки B-LCL, культивируемые методом лизиса эритроцитов, были значительно более жизнеспособными, чем культура, созданная с использованием метода разделения градиента плотности. После освоения процесс трансформации вируса ВЭБ может быть выполнен за 30 минут, если он выполнен правильно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как установить B-LCL с помощью простого и экономящего время метода лизиса эритроцитов без предварительной очистки лимфоцитов. После своего развития этот метод ускорил прогресс в изучении геномики, транскриптомики и протеомики заболеваний, связанных с ВЭБ, и его применение в производстве мононуклеарных антител. Не забывайте, что работа с человеческими патогенами, такими как ВЭБ, может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности.