Выделение эндотелиальных клеток-предшественников от здоровых добровольцев и их миграционном потенциал Под влиянием Образцы сыворотки после кардиохирургии

Общая цель данной процедуры изоляции клеток и протокола миграции состоит в том, чтобы показать надежный способ выделения эндотелиальных клеток-предшественников и их миграционного потенциала в образцах сыворотки кардиохирургических пациентов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы регенерации эндотелиальной выстилки и кровеносных сосудов, которая необходима после кардиохирургических вмешательств из-за травм, связанных с ишемией и реперфузией. Основным преимуществом данной методики является относительно простой способ выделения клеток-предшественников, включающий предварительную изоляцию CD-34-положительных клеток.

В дополнение к смертельным исходам, серьезные осложнения кардиохирургии остаются слишком распространенными. Подчеркивая необходимость выявления риска связывания и защитных механизмов во время кардиохирургических операций. Эндотелиальные клетки-предшественники играют решающую роль в неоваскуляризации ишемизированных тканей и, как известно, обладают кардиопротекторными свойствами.

Чтобы начать эксперимент, смешайте кровь один на один с PBS без кальция и без магния. Добавьте 15 миллилитров градиентного раствора плотности в 50-миллилитровую трубку. И медленно нанесите слой разбавленной крови поверх раствора градиента плотности.

Далее центрифугируйте образцы. С помощью стерильной пластиковой пипетки тщательно соберите слой охристого покрытия каждой пробирки и поместите его в другую пробирку, избегая раствора градиента плотности. Разбавьте мононуклеарные клетки периферической крови, или фракцию PBMC, не менее чем тремя объемами PBS и смешайте раствор с помощью пипетирования.

Центрифугируйте смесь при комнатной температуре в течение 15 минут при 200-кратном С. Затем аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах среды для роста эндотелиальных клеток, MV-2. После ресуспензии клеток добавьте 100 микролитров человеческого антитела к CD-34 на каждую использованную охристую шерсть и вращайте клетки. Добавьте 50 микролитров магнитных шариков, покрытых декстраном, на используемое охристое покрытие и вращайте ячейки.

После инкубации перенесите суспензию в факсимильные трубки, максимум по три миллилитра на каждую трубку. Далее вставьте факсимильные трубки в магниты и подождите пять минут. Выбросьте супернатант, не вытаскивая факсимильные трубки из магнита.

Затем, вне магнитов, повторно суспендируйте элементы в каждой факсимильной трубке тремя миллилитрами среды MV-2. Переложите суспензию ячеек в колбы Т-75 с предварительно покрытым покрытием. Добавьте в каждую колбу по 17 миллилитров среды МВ-2.

Для приготовления миграционного анализа с помощью пипетки удаляют среду из эндотелиальных клеток-предшественников или ЭПК в колбе Т-75. Промойте клетки пятью миллилитрами фосфатно-солевого буфера или PBS и тщательно встряхните колбу. Далее удалите PBS и добавьте пять миллилитров коммерческого раствора для отслоения клеток.

Затем подождите, пока клетки отсоединятся под световым микроскопом. Ускорьте отсоединение, осторожно постукивая по дну колбы. Когда клетки отделятся, быстро добавьте пять миллилитров полной среды MV-2, и переложите клеточную суспензию в другую пробирку.

Центрифугируйте клетки при давлении 2 000 x G в течение пяти минут. После гранулирования клеток повторно суспендируйте их в пяти-десяти миллилитрах PBS. И снова центрифугировать их.

Снова суспендируйте клетки в пяти-десяти миллилитрах PBS и затем центрифугируйте. Ресуспендируйте клеточную таблетку в среде, лишенной МВ-2. Затем разведите образец сыворотки от одного до пяти в среде, лишенной MV-2.

Подготовьте миграционную пластину, добавив 235 микролитров образца сыворотки в нижнюю камеру. Добавьте вкладыш незадолго до добавления раствора ячейки. Затем добавьте 75 микролитров клеточного раствора в верхнюю камеру.

Разрешите миграцию EPC. Удалите верхнюю камеру, содержащую все немигрировавшие клетки. Добавьте 75 микролитров 3,6-процентного раствора параформальдегида, включая краситель Гехста, разведенный в соотношении один к 1000.

Кратковременно центрифугируйте планшет, чтобы все элементы оказались в одной фокальной плоскости при 2000 x G в течение одной-двух минут. Чтобы избежать артефактов автофлуоресценции сыворотки, количественно оцените мигрировавшие клетки, сделав пять снимков из каждой лунки со 100-кратным увеличением под микроскопом. Наконец, подсчитайте мигрировавшие ячейки с помощью полуавтоматического программного обеспечения.

Факсимильный анализ ЭПК подтверждает поглощение acLDL, а также экспрессию CD-31 на поверхности изолированной клеточной популяции. Выделение анализа acLDL и CD-31 позволяет выявить однородное распределение каждого маркера. Elyso для определения влияния кардиохирургии после реперфузионного повреждения миокарда на концентрации циркулирующих сывороточных уровней MIF, CXCL12, CXCL8 и VEGF.

Образцы сыворотки крови отбирали до и во время операции. Сывороточные уровни MIF, CXCL12 и CXCL8 показали значительное интраоперационное повышение по сравнению с исходными значениями. Напротив, концентрации VEGF не показали каких-либо существенных изменений.

Анализ миграции ex vivo с использованием образцов сыворотки, взятых до и во время операции, был проведен с использованием ЭПК, выделенных от здоровых добровольцев, и показал значительно повышенную скорость миграции в сторону интраоперационно взятых образцов. Следуя этой методике, мононуклеарные клетки периферической крови могут быть легко изолированы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, связанные с воспалением.