Направлено дифференциация примитивные и окончательного гемопоэтических прародителей от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы направить дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток человека в направлении примитивной или окончательной гемопоэтической программы с использованием поэтапного подхода к манипулированию сигналами. Этот метод может решить многие ключевые вопросы в этой области, такие как понимание сигнальных и транскрипционных регуляторов окончательного кроветворения человека. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она мгновенно использует специфичные для этапа манипуляции.

Эту процедуру демонстрирует Карисса Деге, постдок в моей лаборатории. Чтобы начать работу с протоколом, получите заранее подготовленные линии плюрипотентных стволовых клеток человека или HPSC, выращенные на эмбриональных фибрбластах мышей или MEF до 70–80% конфлюентности в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с пятью процентами CO2. Аспирируйте среду HPSC и добавьте по одному миллилитру 37 градусов Цельсия 0,25% трипсина ЭДТА в каждую лунку в течение одной минуты.

Через минуту аспирируйте трипсин и добавьте по одному миллилитру исходной среды в каждую лунку. С помощью скребка для клеток соскребите клетки с пластины. Затем добавьте по одному миллилитру буфера для промывки в каждую лунку.

С помощью двухмиллилитровой серологической пипетки растирайте клетки от трех до пяти раз, чтобы разбить большие комки. И перенести клетки в 50-миллилитровую коническую трубку. Центрифугируйте HPSC при давлении 330 x G в течение пяти минут.

После отжима добавьте среду HPSC и повторно суспензируйте ячейки. Затем добавьте по два миллилитра ресуспендированных HPSC в каждую лунку пластиковой посуды с кодом MAT и инкубируйте клетки в течение ночи. Через 24 часа аспирируйте среду и замените ее на 37 градусов Цельсия 0,05% трипсина ЭДТА на одну минуту.

Аспирируйте трипсин ЭДТА. Добавьте один миллилитр исходной среды и энергично соскребите клетки скребком для клеток. Затем добавьте один миллилитр промывочного материала.

С помощью двухмиллилитровой серологической пипетки трижды разрастить клетки и перенести их в 50-миллилитровую коническую трубку. Центрифугируйте ячейки при температуре 220 x G в течение пяти минут. Затем аспирируйте среду, добавьте 20 миллилитров промывочной среды и с помощью пятимиллилитровой серологической пипетки аккуратно восстановите суспендию клеток.

После центрифугирования и аспирации осторожно повторно суспендируйте эмбриоидные тельца или БЭ в среде нулевого дня. Диспонируйте по два миллилитра дифференцировочной среды, содержащей БЭ, в каждую лунку шестилуночной чашки для клеточных культур с низким уровнем адгезии с помощью десятимиллилитровой серологической пипетки. Поместите EB в мультигазовый инкубатор с температурой 5 процентов CO2 и 5 процентов O2 при температуре 37 градусов Цельсия.

Через двадцать четыре часа добавьте два миллилитра первого дня среды. Инкубируйте клетки на ночь в мультигазовом инкубаторе. Через 18 часов аккуратно соберите БЭ с помощью пятимиллилитровой серологической пипетки и вращайте их при 100 x G в течение пяти минут.

Вымойте и смешайте всю культуру с десятью миллилитрами модифицированной среды Dulbecco от Iscove или IMDM. После повторного вращения культуры при 100 Х G в течение пяти минут для удаления мусора, отсасывайте среду. Аккуратно восстановите суспендию EB с помощью Day Two Media с помощью пипетки P1000.

Затем диспонируйте два миллилитра БЭ на лунку в шестилуночные планшеты для клеточных культур с низкой адгезией. Добавьте три микромолярных CHIR99021 или IWP2, чтобы указать дефинитивных или примитивных гематопоэтических прародителей соответственно. Инкубируйте планшет в мультигазовом инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение 30 часов.

Через 30 часов изолируйте БЭ с помощью двухмиллилитровой серологической пипетки, перенеся их в 50-миллилитровую коническую трубку и центрируя при 330 x G в течение пяти минут. Аккуратно повторно суспензируйте EB и промойте их 10 миллилитрами IMDM. Повторно суспендируйте БЭ в среде третьего дня и распределите по два миллилитра в каждую лунку шестилуночных планшетов с низкой адгезией.

Инкубируйте клетки в мультигазовом инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение 72 часов. После 72 часов инкубации добавьте в каждую лунку по два миллилитра Day Six Media. Затем инкубируйте БЭ в мультигазовом инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия еще 48 часов.

Выделите БЭ, обработанных CHIR99021, на восьмой день дифференцировки и перейдите к следующему разделу. Центрифугируйте БЭ при 330 x G в течение пяти минут. Аспирируйте надосадочную жидкость.

Затем добавьте два миллилитра 0,25% трипсина ЭДТА к ЭБ. Ввергните Эб в вихрь в течение пяти секунд и инкубируйте Эб в водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение восьми минут. Затем добавьте пять миллилитров стоп-раствора и центрифугируйте БЭ.

Затем аспирируйте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте БЭ в пяти миллилитрах коллагеназы II. Перебейте трубку на пять секунд, а затем инкубируйте БЭ на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Через 60 минут встряхните БЭ в течение пяти секунд и добавьте пять миллилитров стоп-раствора.

После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре буфера FACS. Пропустите клетки через клеточный фильтр толщиной 40 микрон, чтобы удалить недиссоциированные клеточные комки. Продолжить мечение антител и выделение FACS CD34-положительных гемогенных эндотелиальных предшественников.

После выделения с помощью FACS суспендируйте клетки в средах HE. Распределите клетки по 50 микролитров в 96-луночной культуральной тарелке с низкой адгезией, а затем инкубируйте клетки в течение ночи. На следующее утро кроветворные предшественники должны объединиться в скопления от шести до десяти клеток.

Аккуратно перенесите 50-миролитерные объемы реагрегированных ячеек в центр 24-луночного планшета с кодировкой MAT. Аккуратно поместите планшет в мультигазовый инкубатор на четыре-шесть часов, пока ячейки не прикрепятся. Через четыре-шесть часов, чтобы дать возможность клеткам прикрепиться, медленно добавьте по одному миллилитру свежеприготовленной среды HE в каждую лунку.

Инкубируйте клетки в мультигазовом инкубаторе до тех пор, пока не станут видны гематопоэтические клетки. Затем соберите окончательные гематопоэтические предшественники, аккуратно удалив среду HE из клеток и пропустив через клеточный фильтр толщиной 40 микрон для сбора проточного материала. Для остальных адгезивных клеток добавьте в клетки 0,5 миллилитра 0,25% трипсина ЭДТА и инкубируйте их в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут.

После трипсинизации добавьте по 0,5 миллилитра стоп-раствора в каждую лунку. Пропустите клетки через один и тот же 40-микронный сетчатый фильтр, чтобы объединить все адгезивные и неадгезивные клетки вместе и вращать клетки. Добавьте от 2 000 до 10 000 изолированных FACS клеток в одну лунку клеток OP9 DL4 в среде OP9.

Инкубируйте в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% CO2. Для прохождения клеток каждые четыре-пять дней растирайте клетки с помощью пипетки объемом в один миллилитр. Пропустите через фильтр 40 микрон, чтобы удалить комки.

После центрифугирования аспирируйте среду. Повторно суспендируйте клетки в двух миллилитрах свежей Т-клеточной среды и поместите их на свежие клетки OP9 DL4. По прошествии не менее 21 дня после культивирования холода энергично растирайте клетки и пропустите их через фильтр толщиной 40 микрон для удаления клеточного мусора.

Центрифугируйте при 330 x G в течение пяти минут и аспирируйте надосадочную жидкость, а затем продолжайте использовать стандартную проточную цитометрию. Проточная цитометрия показывает, что культуры, обработанные IWP2, позволяют получить отчетливую CD34-положительную, CD43-отрицательную и CD34-низкую CD43-положительную популяцию. В то время как культуры, обработанные CHIR, имеют менее 1% CD43-положительных клеток на восьмой день дифференцировки.

Примитивные гемопоэтические предшественники, полученные в условиях IWP2, выделенные на девятый день, дадут начало преимущественно примитивным эритроидным и миелоидным предшественникам в анализах метилцеллюлозы. CD34-положительная CD43-отрицательная популяция, полученная в результате CHIR99021 лечения, представляет собой гетерогенную популяцию, содержащую эндотелиальные предшественники, а также CD34-положительный, CD43-отрицательный, CD73-отрицательный, CD184-отрицательный гемогенный эндотелий, который при выделении с помощью FACS первоначально образует монослой эндотелиальноподобных клеток, которые затем претерпевают эндотелиально-гемопоэтический переход, приводящий к круглому, рефрактильному, неадгезивные кроветворные клетки. Эти кроветворные клетки могут быть оценены с помощью проточной цитометрии на экспрессию CD34 и CD45.

Гемопоэтические предшественники, выделенные из анализов EHT, могут быть использованы в анализах метилцеллюлозы и дают начало большим, взрывообразным, эритроидным колониеобразующим единицам, малым эритроидным колониеобразующим единицам и миелоидным предшественникам. Эти репрезентативные проточные цитометрические анализы потенциала анализов Т-лимфоцитов CHIR99021-положительных, CD43-отрицательных, CD73-отрицательных, CD184-отрицательных гемопоэтических предшественников и CD34-положительных, CD43-отрицательных гемопоэтических предшественников IWP2 показывают наличие CD45-положительной, CD56-отрицательной, CD4-положительной, CD8-положительной популяции в предшественниках, полученных от CHIR, что указывает на гемопоэтический потенциал в входной популяции CD34-положительных. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как дифференцировать плюрипотентные стволовые клетки человека в примитивное или определенное количество гемопоэтических предшественников.