Флуоресцентным на основе анализа Лимфоцит Подходит для высокопроизводительного скрининга малых молекул

Общая цель этого флуоресцентного анализа лимфоцитов заключается в выявлении новых низкомолекулярных иммуномодуляторов. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы иммунологии о механизмах активации и ингибирования лимфоцитов. Главное преимущество этого фенотипического функционального анализа заключается в том, что он может быть адаптирован для поиска и разработки новых лекарственных препаратов.

Процедуру продемонстрирует Ахмед Фуда, аспирант нашей лаборатории. В стерильном боксе продезинфицируйте шерсть самки мыши Nurr77 GFP в возрасте от шести до восьми недель 70% ethanol и положите животное на правый бок. Затем сделайте разрез кожи и мышц в верхнем левом квадранте брюшной полости, найдите и извлеките селезенку, поместив ткань в среду для спленоцитов на льду.

После сбора всех селезёнок перенесите ткани в чашку для культивирования клеток размером 10 см², содержащую 5 мл предварительно прогретой среды для спленоцитов, и с помощью стерильного поршня шприца раздавите ткани до помутнения раствора. После тщательного раздавливания в среде для спленоцитов профильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр с размером пор 70 мкн в пробирку объемом 50 мл для удаления остатков тканей, а затем центрифугируйте полученную суспензию одиночных клеток. Ресуспендируйте осадок в 2–3 мл буфера для лизиса эритроцитов, остановив реакцию добавлением 5 мл RPMI или другого подходящего буфера через 20–30 секунд.

Затем соберите клетки путем повторного центрифугирования и ресуспендируйте осадок в двух миллилитрах среды для спленоцитов для подсчета клеток. Для выделения T-клеток снова центрифугируйте клетки и ресуспендируйте осадок в безсывороточной среде RPMI до концентрации 1 × 10⁷ клеток на миллилитр. Перенесите клетки в пятимиллилитровую полистирольную пробирку и отберите аликвоту спленоцитов объемом 100 µL для последующей оценки чистоты.

Затем добавьте к клеткам нормальную сыворотку крысы из расчета 50 µL на 1 mL, после чего добавьте коктейль антител для выделения Т-клеток из расчета 50 µL на 1 mL, осторожно перемешав смесь. Через 10 минут инкубируйте клетки с магнитными бусинами, конъюгированными со стрептавидином, в течение двух с половиной минут. Затем добавьте к клеткам безсывороточную среду до конечного объема 2,5 mL и поместите пробирку в магнит для выделения клеток на три минуты.

По окончании инкубации, удерживая пробирку на магните, одним движением перелейте супернатант в новую полистирольную пробирку. Затем можно приступать к подсчету Т-клеток. Перенесите Т-клетки в 96-луночный планшет с круглым дном в концентрации 2,5 × 10⁵ клеток на лунку, содержащую 200 µL свежей среды для спленоцитов на лунку.

Добавьте рекомбинантный интерлейкин 7 и магнитные бусины CD3/CD28 в соответствующие лунки и поместите планшет в инкубатор для культур клеток. Через 12 часов осторожно тритурируйте клеточную суспензию в каждой лунке, чтобы разрушить любые агрегаты клеток с бусинами. Затем перенесите клеточные суспензии из каждой лунки в отдельные пятимиллилитровые полистирольные пробирки.

После сбора всех клеток каждую пробирку с клетками помещают в сепарационный магнит на пять минут; по окончании каждого периода инкубации супернатанты сливают в новые полистироловые пробирки, пока пробирка все еще находится в магните. Затем клетки собирают путем центрифугирования и ресуспендируют осадки в свежей среде для спленоцитов до концентрации 2 × 10⁶ клеток/мл. Для проведения высокопроизводительного скрининга малых молекул в лунки 384-луночного планшета вносят по 40 µL клеточной суспензии, после чего соответствующие лунки обрабатывают выбранным препаратом или контролем (растворителем) в течение требуемого периода в инкубаторе для культур клеток.

За 30 минут до проведения анализа GFP окрасьте клетки подходящей концентрацией раствора Hoechst, тщательно распределяя краситель осторожным пипетированием. После окрашивания всех лунок центрифугируйте планшеты, чтобы собрать клетки на дне лунок, и оставьте их на 15 минут при комнатной температуре. Загрузите планшет в соответствии с инструкциями производителя.

Затем установите объектив с увеличением 40X или более. Настройте камеру номер четыре для УФ-лампы, а камеру номер один — для лазера 488. Поместите планшет в систему высокопроизводительного скрининга.

Затем настройте автоматизированную систему конфокального высокопроизводительного скрининга для считывания от шести до 10 полей на лунку с двумя последовательными считываниями на поле при 488 нм и УФ-излучении. CD3-положительные Т-клетки составляют примерно 30% селезенки данной мыши, демонстрируя 10% базальной экспрессии GFP. После стимуляции Т-клеточного рецептора с помощью бусин CD3/CD28 наблюдается пяти-шестикратное увеличение процента экспрессии GFP.

Аналогично, CD19-положительные B-клетки составляют от 50 до 55% от общего числа спленоцитов, при этом базальный уровень экспрессии GFP схож с таковым у неактивированных T-клеток. Интересно, что стимуляция B-клеточного рецептора с помощью анти-мышиных IgG, IgM и рекомбинантного CD40L вызывает лишь незначительное увеличение экспрессии GFP. После изоляции с помощью магнитных частиц, как было показано выше, изолированные CD3-положительные T-клетки по-прежнему демонстрируют базальную экспрессию GFP на уровне 10%.

Стимуляция микросферами CD3/CD28, однако, вызывает значительное повышение отклика GFP. Аналогичным образом, после выделения B-клеток с помощью магнитных микросфер очищенные активированные B-клетки демонстрируют более высокую экспрессию GFP по сравнению с активированными B-клетками в спленоцитах. В данном репрезентативном эксперименте первичный высокопроизводительный скрининг 4398 соединений выявил несколько активаторов и ингибиторов активации T-клеток.

Однако наблюдаемая экспрессия GFP в стимулированных Т-клетках была в 20 раз выше, чем в нестимулированных Т-клетках. Это позволило создать «окно» рабочей зоны, в которой можно было легко обнаружить ингибирующие GFP соединения. После освоения данной методики её выполнение при соблюдении всех правил занимает от 36 до 48 часов.

При выполнении данной процедуры важно не забывать проводить подсчет клеток после каждого этапа. После завершения этой процедуры для получения дополнительных ответов могут быть использованы другие методы, такие как ELISA или вестерн-блоттинг. Данная методика заложит основу для поиска препаратов для иммуномодуляции у грызунов.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать и активировать T- или B-клетки, полученные из мышей линии Nurr77 GFP.