Флуоресцентным на основе анализа Лимфоцит Подходит для высокопроизводительного скрининга малых молекул

Общей целью этого анализа лимфоцитов на основе флоресценции является идентификация новых низкомолекулярных иммуномодуляторов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии о механизме активации и торможения лимфоцитов. Основное преимущество этой фенотипической функции и анализа в том, что его можно адаптировать для разработки лекарственных препаратов.

Демонстрировать процедуру будет Ахмед Фуда, аспирант нашей лаборатории. Под стерильным рабочим капюшоном продезинфицируйте шерсть самки мыши Nurr77 GFP в возрасте от шести до восьми недель с содержанием этанола 70% и положите животное на правый бок. Затем сделайте разрез на коже и мышцах верхнего левого брюшного квадранта, а также найдите и удалите селезенку, поместив ткань в среду спленоцитов на льду.

Когда все селезенки будут собраны, перенесите ткани в чашку для клеточных культур площадью 10 квадратных сантиметров, содержащую пять миллилитров предварительно подогретой среды спленоцитов, и используйте стерильный поршень шприца, чтобы размять ткани до тех пор, пока раствор не станет мутным. После интенсивного затирания в среде спленоцитов отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр размером 70 микрон в 50-миллилитровую пробирку, чтобы удалить любой мусор, и центрифугируйте полученную одноклеточную суспензию. Повторно суспендируйте гранулу в двух-трех миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов, пропитав реакцию пятью миллилитрами RPMI или другим подходящим буфером через 20-30 секунд.

Затем соберите клетки с помощью еще одного центрифугирования, и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах спленоцитарной среды для подсчета клеток. Чтобы изолировать Т-клетки, снова центрифугируйте клетки и повторно суспендируйте гранулу в свободной от сыворотки среде RPMI в концентрации от 10 до 7 клеток на миллилитр. Переложите клетки в пятимиллилитровую полистирольную трубку и отложите 100 микролитров аликвоты спленоцитов для использования позже для оценки чистоты.

Далее добавьте в клетки 50 микролитров на миллилитр нормальной сыворотки крови крысы с последующим добавлением 50 микролитров на миллилитр коктейля антител для выделения Т-клеток с аккуратным перемешиванием. Через 10 минут инкубируйте клетки с конъюгированными стрептавидином магнитными шариками в течение двух с половиной минут. Затем добавьте в клетки свободную от сыворотки среду для получения окончательного объема два с половиной миллилитра и поместите пробирку в магнит для изоляции клеток на три минуты.

По окончании инкубации, удерживая трубку в магните, одним движением залейте надосадочную жидкость в новую полистирольную трубку. Затем можно подсчитать Т-клетки. Высевать Т-клетки в круглое дно 96-луночного планшета в концентрации от 2,5 до 10-5 клеток на лунку, содержащую 200 микролитров свежей среды спленоцитов на лунку.

Добавьте рекомбинантные магнитные шарики интерлейкина 7 и CD3/CD28 в соответствующие лунки и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур. Через 12 часов осторожно растирайте клеточную суспензию в каждой лунке, чтобы разрушить любые клеточные агрегаты гранул. Затем переложите клеточные суспензии из каждой лунки в отдельные пятимиллилитровые полистирольные трубки.

Когда все клетки будут собраны, поместите каждую трубку с клетками в разделительный магнит на пять минут за раз и сцеживайте надосадочную жидкость, когда трубка все еще находится внутри магнита, в новые полистирольные трубки в конце каждой инкубации. Затем соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулы в свежей среде спленоцитов в концентрациях от двух до 10-6 клеток на миллилитр. Для высокопроизводительного скрининга малых молекул поместите 40 микролитров клеток в лунку в 384-луночный планшет и обработайте соответствующие лунки выбранным препаратом или носителем в течение желаемого периода лечения в инкубаторе для клеточных культур.

За 30 минут до анализа GFP окрасьте клетки соответствующей концентрацией раствора Хёхста, тщательно распределив пятно с помощью щадящего пипетирования. Когда все лунки будут окрашены, центрифугируйте планшеты, чтобы собрать клетки на дне лунок, и дайте им отдохнуть в течение 15 минут при комнатной температуре. Загрузите пластину в соответствии с инструкциями производителя.

Затем установите цель на 40X или выше. Установите камеру номер четыре для УФ-лампы, а затем установите камеру номер один для лазера 488. Загрузите пластину в систему просеивания с высоким содержанием содержимого.

Затем настройте автоматизированную конфокальную систему скрининга с высоким содержанием золота для считывания от шести до 10 полей на лунку с двумя последовательными показаниями на поле с точностью 488 нанометров и ультрафиолетовым светом. CD3-положительные Т-клетки составляют примерно 30% данной селезенки мыши, демонстрируя 10%-ную базальную экспрессию GFP. После стимуляции гранул рецепторов CD3/CD28 Т-клеток наблюдается пяти-шестикратное увеличение процента экспрессии GFP.

Аналогичным образом, CD19-положительные В-клетки составляют от 50 до 55% от общего числа спленоцитов с базальной экспрессией GFP, аналогичной экспрессии неактивированных Т-клеток. Интересно, что стимуляция рецепторов В-клеток с использованием антимышиных IgG, IgM и рекомбинантного CD40L вызывает лишь незначительное увеличение экспрессии GFP. После выделения магнитных шариков, как только что было продемонстрировано, выделенные CD3-положительные Т-клетки все еще демонстрируют 10%-ную базальную экспрессию GFP.

Стимуляция гранул CD3/CD28, однако, вызывает значительное повышение регуляции ответа GFP. Аналогичным образом, после выделения магнитных шариков В-клеток очищенные активированные В-клетки демонстрируют более высокую экспрессию GFP по сравнению с активированными В-клетками в спленоцитах. В этом репрезентативном эксперименте первичный высокопроизводительный скрининг 4398 соединений выявил несколько активаторов и ингибиторов активации Т-клеток.

Но наблюдаемая экспрессия GFP у стимулированных Т-клеток в 20 раз выше, чем у нестимулированных Т-клеток. Это позволяет создать окно зоны действия, в котором ингибирующие соединения GFP могут быть легко обнаружены. После освоения этой техники она может быть выполнена за 36-48 часов, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о подсчете клеток после каждого шага. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ИФА или вестерн-блоттинг, чтобы ответить на любые другие дополнительные вопросы. Этот метод проложит путь к открытию лекарств для иммуномодуляции у грызунов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять и активировать Т- или В-клетки, полученные из мышиных пластин Nurr77 GFP.