Локальное поле флуоресцентной микроскопией: Визуализация клеточных сигналов в интактных сердцах
8 марта 2017 г.
В самом центре, молекулярные события координировать электрическую и сократительную функцию органа. Набор локальных методов микроскопии поля флуоресценции, представленные здесь позволяет записывать клеточных переменных в интактных сердцах. Выявление механизмов, определяющих функцию сердца имеет решающее значение для понимания того, как сердце работает в патологических ситуациях.
Общая цель этого метода визуализации флуоресцентной микроскопии локального поля заключается в использовании молекулярных зондов для измерения внутриклеточного уровня кальция или мембранных потенциалов в труднодоступных областях сердца на уровне всего сердца. Этот метод может помочь нам ответить на ключевые сердечно-сосудистые вопросы, связанные с остановкой сердца и ишемией. Основное преимущество этого метода заключается в том, что сердечные свойства измеряются по клеточным событиям в интактном органе, где клетки продолжают быть электрическими, механическими и метаболически связанными.
Для начала подготовьте горизонтальный аппарат Лангендорфа. Загрузите свежеприготовленный раствор Tyrode в шприцы объемом 60 миллилитров и добавьте все соответствующие трубки установки. После наполнения удалите все пузырьки воздуха.
Затем уравновесьте загруженный раствор чистым газообразным кислородом, подаваемым из погруженного в воду пластикового воздушного камня. Затем наложите на иглу нерассасывающийся хирургический шов. Это будет служить канюлей для ретроперфузии сердца при подключении к аппарату.
Далее соберите сердце после инъекции гепарина и усыпления животного. Сначала очистите грудную клетку этанолом. Демонстрация проводится с мышью, но та же процедура работает и для забора сердца попугая.
Далее с помощью ножниц для препарирования сделайте разрез в нижней части живота, а затем разрежьте бока по направлению к шее. Затем осторожно разрежьте диафрагму, избегая сердца. Теперь оттяните разрезанную ткань назад и прижмите ее.
Затем удалите легкие и окружающие ткани, чтобы обнажить сердце. После обнажения используйте пинцет, чтобы вычерпать сердце, не сдавливая его. Отделите его от животного, перерезав аорту, и оставьте как можно больше аорты прикрепленной к сердцу.
Затем загрузите сердце в небольшую лодку для взвешивания с одним миллилитром раствора Tyrode. Под рассекающим микроскопом быстро удалите кровь и жировую ткань, окружающую сердце, с помощью пинцета и ножниц. С помощью нерассасывающегося хирургического шва и иглы приложите аорту к горизонтальному соединению аппарата Лангендорфа.
Закрепите узел с помощью двух тонких пинцетов. Затем начните ретроперфузию, открыв клапан для выпуска раствора Tyrode. Очистите окружающие ткани и отсосите мусор, чтобы поддерживать горизонтальную камеру в чистоте, пока сердце стабилизируется в течение 10 минут.
Сделайте краситель свежим. Для Rhod-2 AM добавьте 20 микролитров 20% Pluronic и ДМСО в упаковку красителя размером 50 микрограммов. Перемешивайте с помощью пипетки, не допуская образования пузырьков.
Затем перелейте разжиженный краситель в прозрачный стеклянный флакон и добавьте один миллилитр раствора Tyrode. Тщательно растворите краситель в этой смеси, используя от 15 до 20 минут ультразвуковой обработки. Далее перфузируйте приготовленный краситель с помощью перистальтического насоса при комнатной температуре.
Сначала загрузите краситель в камеру красителя, а затем зажмите все трубопроводы, подключенные к коллектору, и держите зажимы над коллектором, чтобы предотвратить обратный поток. Далее включите насос и сразу же закройте трехходовой клапан ниже шприца объемом 60 миллилитров. Расположите маленькую трубку, прикрепленную к всасывающему концу насоса, рядом с сердцем, чтобы рециркулировать краситель после его перфузии.
Возьмите маленькую измерительную иглу и зажмите ее через верхушку, чтобы сбросить давление. Затем дайте сердцу пропитаться красителем в течение 30 минут. В это время очень важно оценить уровень красителя, чтобы в ткани не попали пузырьки, которые могли бы вызвать ишемию и повреждение тканей.
После перфузии красителя ретроперфузируйте сердце раствором Тайрода. Снимите зажим над коллектором. Откройте клапан, а затем дайте сердцу стабилизироваться в течение 10 минут.
Во время ретроперфузии заполните горизонтальную камеру раствором Tyrode и включите блок Пельтье, чтобы довести температуру ванны до 37 градусов по Цельсию. Чтобы подготовить оптоволоконный светильник к эксперименту, сначала поместите его внутрь двухмиллилитровой пипетки. А затем приложить пипетку к микроманипулятору.
С помощью микроманипулятора слегка прижмите оптоволокно к поверхности бокового желудочка. Далее запрограммируйте генератор волн на выдачу квадратного импульса шириной в одну миллисекунду. И установите сердечный стимулятор, который будет внешне синхронизирован и подключен к генератору волн.
К каждому из двух выходов стимулятора прикрепите провод с припаянной на конце акупунктурной иглой. Прикрепите две акупунктурные иглы к верхушке сердца на расстоянии около трех миллиметров друг от друга. Только после того, как иглы будут размещены, запускайте стимулятор, тем самым избегая случайных толчков.
Теперь, чтобы записать эпикардиальный сигнал, настройте частоту регистрации в программном обеспечении на 10 килогерц. Чтобы собрать сигнал эндокарда, следуйте той же процедуре, но используйте иглу 23 калибра, чтобы проткнуть отверстие в боковом желудочке рядом с перегородкой. А затем с помощью микроманипулятора ввести второе оптоволокно в эндокард.
Для доступа к трансмуральной функции сравнивали морфологию потенциалов действия, регистрируемых эндокардом и эпикардом. Флуоресцентные записи были сделаны после лечения сердца ди-8-ANEPPS по методике CLFFM. Потенциал действия был медленнее в эндокарде, особенно в первой фазе.
Продолжительность потенциала действия была описана как время, необходимое для того, чтобы потенциал действия повторно поляризовался до определенной степени. Когда длительности были нормализованы и сдвинуты для перекрытия в нулевой фазе, их можно было сравнивать. На первом этапе действительно наблюдалась значительная разница.
Далее был использован Rhod-2 AM для мониторинга внутриклеточного кальция. Для сравнения региональных различий во внутриклеточном кальции была оценена кинетика транзиторности кальция. Для сравнения, время до пика транзиторности было примерно на две миллисекунды больше в эндокарде.
В целом, кальциевая транзиторность эндокарда имела значительно более медленную кинетику, чем эпикард. После освоения этой техники можно использовать для регистрации внутриклеточной кальциевой быстротечности и потенциалов действия в труднодоступных областях сердца. Часть установки Лангендорфа делает очень практичным перфузию различных химических веществ в сердце и оценку влияния на сердечные свойства.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод локально-полевой флуоресцентной микроскопии для измерения внутриклеточного уровня кальция и мембранных потенциалов в сердце. Этот метод позволяет исследовать функцию сердца в неповрежденных органах, что имеет решающее значение для понимания таких состояний, как остановка сердца и ишемия.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Физиология сердечно-сосудистой системы
- Флуоресцентная микроскопия
- Методы визуализации клеток
Теоретические основы
- Понимание функций сердца имеет решающее значение для борьбы с сердечными заболеваниями.
- Традиционные методы могут быть недостаточно эффективны для доступа ко всем областям сердца.
- Флуоресцентная микроскопия локального поля предлагает новый подход к изучению клеток сердца.
- Данный метод позволяет сохранить целостность межклеточных связей в сердце.
Цель исследования
- Для измерения внутриклеточного уровня кальция и мембранных потенциалов в сердце.
- Для изучения механизмов сердечной функции при патологических состояниях.
- Для получения данных о сердечно-сосудистых событиях, таких как остановка сердца и ишемия.
Используемые методы
- Подготовка горизонтального аппарата Лангендорфа.
- Заполнение шприцев раствором Тайрода.
- Удаление пузырьков воздуха из установки.
- Использование молекулярных зондов для проведения измерений.
Основные результаты
- Успешное измерение клеточных переменных в интактных сердцах.
- Демонстрация эффективности метода при доступе к труднодоступным областям.
- Полученные данные об электрических и механических свойствах кардиомиоцитов.
- Потенциальные возможности применения метода для изучения патологий сердца.
Выводы
- Метод флуоресцентной микроскопии локального поля представляет большую ценность для кардиологических исследований.
- Данный метод расширяет наше понимание функций сердца в норме и при патологии.
- В будущих исследованиях этот метод может быть использован для более глубокого изучения здоровья сердечно-сосудистой системы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Локальная флуоресцентная микроскопия позволяет измерять внутриклеточный кальций и мембранные потенциалы в интактных сердцах, сохраняя клеточную связь, которая имеет критическое значение для понимания механизмов ишемии и аритмий. Данный подход способствует валидации мишеней, предоставляя физиологически релевантные данные от электрически и механически связанных тканей, что повышает прогностическую достоверность доклинических моделей. Этот метод облегчает снижение механистических рисков, связывая молекулярные сигналы с функцией органа в целом в исследованиях сердечно-сосудистых заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы путем измерения кальциевых транзиентов и потенциалов действия в интактном миокарде при физиологическом сопряжении.
- Операционная ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней в системах, релевантных для конкретных заболеваний, где модели с изолированными клетками не позволяют зафиксировать динамику на тканевом уровне.
- Прогностическая ценность: Способствует сортировке портфеля соединений путем выявления веществ, нормализующих кинетику внутриклеточного кальция в эндокардиальных и эпикардиальных областях.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем установления базовых сигналов флуоресценции в перфузируемых сердцах.
- Количественные данные: Получение воспроизводимых измерений кинетики кальциевых транзиентов и продолжительности потенциала действия для оценки эффекта соединений.
- Повторное использование платформы: Обеспечение масштабируемости для различных моделей грызунов с помощью перфузии по Лангендорфу, что позволяет стабильно получать сигналы в каскадах сердечно-сосудистого скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: позволяет моделировать механизмы ишемии и аритмии путем мониторинга региональных различий в обмене кальция и реполяризации в интактных сердцах.
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между фундаментальными открытиями и доклинической валидацией за счет сохранения электротонического и метаболического сопряжения во время фармакологического вмешательства.
- Принятие решений с учетом рисков: позволяет определить критерии дальнейшего продвижения исследования на основе количественных изменений морфологии потенциала действия и транзиентов кальция в пораженных и подвергнутых лечению тканях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы сердечно-сосудистых исследований — от раннего изучения мишеней до доклинической валидации, способствуя идентификации ведущих соединений-кандидатов путем предоставления данных о сигнализации в физиологическом контексте.
- Биология открытий: Поддерживает проверку гипотез путем измерения потенциала мембраны и содержания кальция в конкретных компартментах (цитозольном и саркоплазматическом ретикулуме) в интактной ткани.
- Скрининг: Обеспечивает получение готовых к анализу препаратов со стабильными показателями флуоресценции для оценки влияния соединений на электрофизиологию сердца и обмен кальция.
- Аналитика: Предоставляет количественные зависимые переменные, включая время достижения пика переходного процесса кальция, продолжительность потенциала действия и метрики фазовой реполяризации для межгруппового сравнения.
- Трансляционные исследования: Связывает молекулярные измерения с функцией всего органа, позволяя согласовать биомаркеры в доклинических моделях сердечной дисфункции.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократную платформу для оценки сердечно-сосудистых рисков в различных терапевтических областях с помощью стандартизированного детектирования флуоресценции на аппарате Лангендорфа.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность путем корреляции субклеточных сигналов с физиологией целого органа в моделях сердечно-сосудистых заболеваний.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированного введения красителя, перфузии и позиционирования оптоволокна в системе Лангендорфа.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем выявления ранних электрофизиологических нарушений и дефектов регуляции кальция до дорогостоящих неудач на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию соединений с учетом рисков на основе нормализованных кинетик потенциала действия и кальциевых транзиентов в больных и восстановленных сердцах.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области диссекции сердца, перфузии по Лангендорфу и приготовления флуоресцентных красителей (например, Rhod-2 AM, di-8-ANEPPS).
- Зависимость от настройки волоконно-оптической микроскопии, генераторов волн для стимуляции и систем сбора данных высокой частоты (10 kHz).
- Необходима кросс-функциональная стандартизация между группами физиологов, специалистов по визуализации и фармакологов для обеспечения согласованности сигналов.
- Требуется учитывать особенности адаптации для разных видов (мышь, попугай) и областей желудочков (эпикард, эндокард) при измерении трансмуральных градиентов.
- Ограничения связаны с эффективностью загрузки красителя и артефактами движения во время перфузии, которые необходимо контролировать во избежание ишемии или искажения сигнала.
