Острые и хронические модели гипергликемии у рыбок данио: метод оценки влияния гипергликемии на нейрогенез и биораспределение радиоактивно меченых молекул

Общая цель данной процедуры состоит в том, чтобы оценить ремоделирование мозга в условиях гипергликемии, а также проследить за радиоактивно мечеными молекулами у рыбок данио. Гипергликемия характеризуется чрезмерной концентрацией глюкозы в крови. Хроническая гипергликемия может быть вызвана диабетическими состояниями и вызывать различные сосудистые дисфункции, которые, в свою очередь, могут вызвать клинические осложнения, такие как инфаркт миокарда, инсульт или диабетические язвы стопы.

Кроме того, острая гипергликемия из-за стресса может способствовать геморрагическим осложнениям при ишемическом инсульте. Рыбки данио являются интересной моделью для понимания болезней человека и их влияния на центральную нервную систему. Это особенно верно, учитывая, что мозг взрослых рыб демонстрирует интенсивную нейрогенную способность и выдающуюся способность к механизмам восстановления мозга по сравнению с млекопитающими, поэтому рыбки данио представляют собой хорошую модель для исследования ремоделирования мозга после стресса в острых и гипергликемических условиях.

Это также позволяет исследовать биораспределение меченых радиоактивных молекул и потенциальных терапевтических агентов. Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами французского и европейского сообщества по использованию животных в исследованиях и одобрены местным этическим комитетом для экспериментов на животных. Аккуратно ловите рыбу сачком.

Положите рыбу в небольшой объем трикаинового анестетика, разведенного до конечной концентрации 0,02% в воде. Подождите, пока рыба перестанет двигаться. Удалите рыбу с помощью разрезанной пипетки и аккуратно положите ее на впитывающую папиросную бумагу, чтобы удалить максимум воды.

Взвесьте рыбу для того, чтобы приготовить шприц с d-глюкозой для инъекций, из 50 микролитров 2,5 грамма на килограмм массы тела. Например, рыба весом 0,6 грамма получит 50 микролитров 3%-ного раствора глюкозы PBS. Положите рыбу на спину, и держите ее одной рукой.

Другой рукой введите иглу шприца во внутрибрюшинную полость, и медленно введите раствор d-глюкозы PBS. Извлеките иглу и опустите рыбу обратно в воду. Проверяйте рыбу до полного выздоровления.

Уровень глюкозы в крови обычно измеряется через 1,5 часа. Для того, чтобы имитировать хроническую гипергликемию, приготовьте двухлитровый баллон с d-глюкозой в конечной концентрации 111 миллимоляров. Для этого нужно взвесить 40 грамм d-глюкозы, и положить ее в пустую емкость.

Наполните резервуар двумя литрами воды для рыб, и поместите в него до семи рыбок. Меняйте раствор глюкозы каждые два дня, во избежание размножения бактерий или других микроорганизмов. Хроническая гипергликемия достигается при 14-дневном лечении d-глюкозой.

Поймайте рыбу сачком, и положите ее на лед. Накройте рыбу льдом для быстрой эвтаназии. Возьмите рыбу и протрите ее, чтобы удалить любые капли воды, которые могли бы разбавить образцы крови.

Удалите глаз с помощью рассекающих щипцов и подождите, пока полость глаза заполнится кровью. Положите тест-полоску на глюкометр, и введите полоску в полость глаза. Обратите внимание на значение концентрации глюкозы в крови.

При острой гипергликемии внутрибрюшинная инъекция d-глюкозы вызывает значительное повышение уровня глюкозы в крови, как показано, через 1 1/2 часа после инъекции. При хронической гипергликемии погружение рыб в раствор d-глюкозы приводит к значительному повышению уровня глюкозы в крови, что показано после 14 дней лечения. В конце процедуры отделите тело от головы с помощью препарирующих ножниц, и поместите голову в 4% параформальдегида, разведенного в PBS для иммуногистохимических экспериментов.

Инкубировать в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. В качестве альтернативы мозг может быть непосредственно извлечен и заморожен для других экспериментов, таких как экстракция мРНК. На следующий день неподвижные головы промывают PBS и поддерживают иглой под препарирующим микроскопом.

Оставшийся глаз удаляется, а верхняя часть черепа аккуратно вскрывается с помощью щипцов. Затем мозг осторожно извлекают и помещают в 1x PBS. Неподвижный мозг обезвоживают ступенчато, в серии повышенных концентраций этанола, за которыми следуют две 30-минутные ванны с толуолом.

Затем мозги помещают в встраиваемую кассету, а крышку тщательно закрывают. Поместите кассету в расплавленный парафин, при температуре от 58 до 60 градусов по Цельсию. Во время парафинового введения в головной мозг включите согревающие щипцы включения.

Поместите кассету в чистую парафиновую ванну. По окончании парафиновых ванн достаньте кассету. Налейте в форму немного жидкого парафина.

Откройте кассету и поместите мозг внутрь расплавленного парафина в форму. Сориентируйте мозг с помощью согревающих щипцов включения. Заполните форму расплавленным парафином и дайте ему застыть на охлаждающей части закладочной машины.

По техническим причинам мозг должен быть расположен в соответствии с передне-задней осью. После извлечения парафинового блока обрежьте его и закрепите на кассете с расплавленным парафином в правильной ориентации, чтобы обеспечить поперечное сечение. Вставьте парафиновый блок в плечо микротома и разрежьте срезы по 50 микрометров, пока не дойдете до уровня образца мозга.

Затем обрежьте парафиновый блок до получения трапеции, и отрегулируйте толщину секции до семи микрометров. Соберите парафиновые ленты тонкой кистью для рисования и положите ее на черную бумагу. Разрежьте парафиновые ленты через каждые три-четыре секции.

Поставьте горку на согревающую тарелку, и залейте ее дистиллированной водой. Аккуратно расположите секции на воде на горке, и прогрейте до 40 градусов по Цельсию. Когда парафиновые ленты достаточно расправятся, удалите воду с впитывающей тканью.

Последние капли удаляются механическим способом, как показано на рисунке. Дайте предметному стеклу высохнуть не менее чем за два часа до выполнения иммуногистохимической процедуры, описанной в протоколе. После иммуногистохимии предметные стекла анализируются под эпифлуоресцентным или конфокальным микроскопом для изучения влияния гипергликемии на пролиферацию клеток мозга.

Количественное определение клеток мозга проводится, по крайней мере, на трех последовательных участках или в области, представляющей интерес. Здесь пролиферативные клетки, соответствующие PCNA-положительным клеткам, выделены зеленым цветом. Как видим, хроническая гипергликемия индуцирует уменьшение количества пролиферативных клеток, помеченных зеленым цветом с антителами к PCNA, в вентральном конечного мозге, дорсальном конечном мозге и каудальном гипоталамусе, вокруг латерального и заднего углубления.

В качестве альтернативы, для изучения влияния гипергликемии на нейрогенез, индуцированный травмой, может быть выполнена травма ножевого мозга во время лечения хронической гипергликемией. Для этого обезболивают семидневную обработанную рыбу, и помещают ее под препарирующий микроскоп. Протолкните шприц 30 калибра вертикально через череп, в центр правого теленцефалического полушария.

После этой процедуры рыбку следует вернуть в свой резервуар на необходимое время. Здесь рыбе позволили выжить в течение семи дней в воде с d-глюкозой, прежде чем она была принесена в жертву. Колотое ранение конечного мозга сильно регулирует пролиферацию в поврежденном полушарии через семь дней после поражения.

Наши данные показывают, что хроническая гипергликемия вызывает значительное снижение процессов заживления мозга за счет уменьшения пролиферации клеток после ножевого ранения конечного мозга. Рыбки данио также могут быть использованы для изучения биораспределения радиоактивно меченых молекул. Здесь мы решили изучить метаболизм глюкозы в организме рыбок данио.

Рыб следует предварительно обезболить, а затем положить на ткань, смоченную анестетиками. Затем рыбу помещают за окном радиозащиты. Готовится шприц, содержащий 50 микролитров фтордезоксиглюкозы.

Рыбу укладывают на спину, и внутрибрюшинно вводят 50 микролитров ФДГ в дозе 20 мегабеккерелей. Затем рыбу кладут на другую ткань, пропитанную анестетиками. Он аккуратно оборачивается и размещается на кронштейне сканера ПЭТ-сканирования.

Рука вставляется в ПЭТ-сканирование, и выполняется процедура визуализации. Здесь можно отметить, что ФДГ обнаруживается не только в месте инъекции, но и в голове рыбы, в частности, в головном мозге и по всему спинному мозгу. В этом исследовании мы предлагаем два различных метода установления острой и хронической гипергликемии у рыбок данио, и мы показываем, что гипергликемия нарушает пролиферацию клеток мозга в нормальных условиях и условиях, вызванных травмой.

В заключение следует отметить, что рыбки данио рерио могут быть использованы в качестве подходящей модели для исследования вредных эффектов гипергликемии в центральной нервной системе. Это также позволяет оценить биораспределение меченых радиоактивных молекул с помощью ПЭТ-сканирования.