Острые и хронические модели гипергликемии у рыбок данио: метод оценки влияния гипергликемии на нейрогенез и биораспределение радиоактивно меченых молекул

Общая цель следующей процедуры заключается в оценке ремоделирования мозга в условиях гипергликемии и отслеживании радиоактивно меченных молекул у zebrafish. Гипергликемия характеризуется избыточной концентрацией глюкозы в крови. Хроническая гипергликемия может быть следствием диабетических состояний и вызывать различные сосудистые дисфункции, которые, в свою очередь, могут привести к клиническим осложнениям, таким как инфаркт миокарда, инсульт или диабетическая стопа.

Кроме того, острая гипергликемия, вызванная стрессом, может способствовать развитию геморрагических осложнений при ишемическом инсульте. Данио-рерио (Zebrafish) представляют собой интересную модель для изучения заболеваний человека и их влияния на центральную нервную систему. Это особенно актуально, поскольку мозг взрослых рыб обладает выраженной нейрогенной способностью и выдающимися механизмами регенерации мозга по сравнению с млекопитающими; таким образом, данио-рерио являются подходящей моделью для исследования ремоделирования мозга после стресса в условиях острой гипергликемии.

Это также позволяет исследовать биораспределение радиоактивно меченых молекул и потенциальных терапевтических агентов. Все эксперименты проводились в соответствии с руководствами Франции и Европейского сообщества по использованию животных в исследованиях и были одобрены местным комитетом по этике экспериментов на животных. Аккуратно выловите рыбу с помощью сачка.

Поместите рыбу в небольшой объем раствора анестетика трикаина с конечной концентрацией 0,02% в воде. Подождите, пока рыба перестанет двигаться. Извлеките рыбу с помощью обрезанной пипетки и аккуратно перенесите ее на абсорбирующую бумажную салфетку, чтобы максимально удалить воду.

Взвесьте рыбу, чтобы подготовить шприц с d-глюкозой для инъекции в объеме 50 мкл из расчета 2,5 г на кг массы тела. Например, рыбе массой 0,6 г введут 50 мкл 3% раствора d-глюкозы в PBS. Положите рыбу на спину и удерживайте её одной рукой.

Другой рукой введите иглу шприца в брюшную полость и медленно введите раствор d-глюкозы в PBS. Извлеките иглу и верните рыбу в воду. Наблюдайте за рыбой до ее полного восстановления.

Уровень глюкозы в их крови обычно измеряют через 1,5 часа. Чтобы имитировать хроническую гипергликемию, приготовьте двухлитровый раствор d-глюкозы с конечной концентрацией 111 мМ. Для этого отвесьте 40 г d-глюкозы и поместите ее в пустую емкость.

Наполните резервуар двумя литрами воды для рыб и поместите в него до семи особей. Заменяйте раствор глюкозы каждые два дня, чтобы предотвратить рост бактерий или других микроорганизмов. Хроническая гипергликемия достигается путем 14-дневного введения d-глюкозы.

Поймайте рыбу с помощью сачка и поместите её на лед. Накройте рыбу льдом для быстрого усыпления. Возьмите рыбу и протрите её, чтобы удалить капли воды, которые могли бы разбавить образцы крови.

Удалите глаз с помощью диссекционных пинцетов и дождитесь заполнения глазницы кровью. Поместите тест-полоску в глюкометр, а затем введите полоску в глазницу. Зафиксируйте значение концентрации глюкозы в крови.

Для моделирования острой гипергликемии вводят внутрибрюшинную инъекцию d-glucose, что вызывает значительное повышение уровня глюкозы в крови, как показано через 1 1/2 часа после инъекции. Для моделирования хронической гипергликемии рыб помещают в раствор d-glucose, что приводит к значимому повышению уровня глюкозы в крови, как показано после 14 дней обработки. По завершении процедуры отделяют туловище от головы с помощью диссекционных ножниц, после чего голову помещают в 4% раствор параформальдегида, разведенный в PBS, для проведения иммуногистохимических исследований.

Инкубируйте в течение ночи при 4°C. В качестве альтернативы мозг можно извлечь сразу и заморозить для других экспериментов, например, для экстракции мРНК. На следующий день фиксированные головы промывают PBS и удерживают иглой под dissecting microscope.

Оставшийся глаз удаляют, после чего осторожно вскрывают верхнюю часть черепа с помощью пинцета. Затем аккуратно извлекают мозг и помещают его в 1x PBS. Фиксированные образцы мозга подвергают ступенчатой дегидратации в серии растворов этанола с возрастающей концентрацией, после чего дважды выдерживают по 30 минут в толуоле.

Затем мозг помещают в водрубильную кассету и осторожно закрывают крышку. Поместите кассету в расплавленный парафин при температуре от 58 до 60 °C. Во время заливки мозга парафином включите подогрев пинцета для включения.

Поместите кассету в чистую парафиновую ванну. По завершении обработки в парафиновых ваннах извлеките кассету. Налейте немного жидкого парафина в форму.

Откройте кассету и поместите мозг в расплавленный парафин в форме. Отрегулируйте положение мозга с помощью прогреваемых пинцетов для заливки. Заполните форму расплавленным парафином и дайте ему затвердеть на охлаждающей платформе прибора для заливки.

По техническим причинам мозг следует расположить вдоль передне-задней оси. После извлечения парафинового блока из формы обрежьте его и зафиксируйте в кассете с помощью расплавленного парафина в правильной ориентации для проведения поперечного сечения. Установите парафиновый блок в держатель микротома и делайте срезы толщиной 50 micrometer до достижения уровня образца мозга.

Затем обрежьте парафиновый блок, чтобы придать ему трапециевидную форму, и установите толщину среза на семь микрометров. Соберите парафиновые ленты с помощью тонкой кисти и поместите их на черную бумагу. Разрезайте парафиновые ленты через каждые три-четыре среза.

Поместите предметное стекло на нагревательную пластину и залейте его дистиллированной водой. Осторожно поместите срезы на поверхность воды на стекле и нагрейте до 40 °C. Когда парафиновые ленты достаточно расправятся, удалите воду с помощью абсорбирующей салфетки.

Последние капли удаляют механически, как показано на видео. Дайте предметному стеклу высохнуть в течение как минимум двух часов перед выполнением процедуры иммуногистохимии, описанной в протоколе. После иммуногистохимического анализа стекла исследуют с помощью эпифлуоресцентного или конфокального микроскопа для изучения влияния гипергликемии на пролиферацию клеток мозга.

Количественный анализ клеток мозга проводится как минимум на трех последовательных срезах или в выбранной области интереса. Здесь пролиферирующие клетки, соответствующие PCNA-положительным клеткам, окрашены в зеленый цвет. Как видно, хроническая гипергликемия вызывает снижение количества пролиферирующих клеток, помеченных антителами к PCNA зеленым цветом, в вентральном телэнцефалоне, дорсальном телэнцефалоне и каудальном гипоталамусе, вокруг латерального и заднего рецессуса.

В качестве альтернативы, для изучения влияния гипергликемии на индуцированный повреждением нейрогенез, можно выполнить нанесение колотой раны в тело конечного мозга во время хронического лечения гипергликемией. Для этого анестезируйте рыбу, получавшую препарат в течение семи дней, и поместите ее под диссекционный микроскоп. Вертикально проколите череп шприцем 30-го калибра, вводя иглу в центр правого полушария конечного мозга.

После завершения данной процедуры рыбу следует вернуть в аквариум на необходимое время. В данном случае рыбы содержались в воде с d-глюкозой в течение семи дней до момента забивания. Колотое ранение телэнцефалона вызывает сильную активацию пролиферации в поврежденном полушарии через семь дней после нанесения травмы.

Наши данные показывают, что хроническая гипергликемия вызывает значительное снижение процессов заживления мозга за счет уменьшения пролиферации клеток после колотой раны телэнцефалона. Zebrafish также могут быть использованы для изучения биораспределения радиоактивно меченных молекул. В данной работе мы решили изучить метаболизм глюкозы в организме zebrafish.

Рыбу следует сначала подвергнуть анестезии и поместить на салфетку, пропитанную анестетиком. Затем рыбу помещают за окно радиационной защиты. Подготавливают шприц, содержащий 50 µl фтордезоксиглюкозы.

Рыбу помещают на спину и вводят внутрибрюшинно 50 µL FDG в дозе 20 MBq. Затем рыбу помещают на другую салфетку, пропитанную анестетиком. Ее осторожно заворачивают и устанавливают в позиционер ПЭТ-сканера.

Руку помещают в ПЭТ-сканер, после чего проводят процедуру визуализации. Здесь можно заметить, что FDG обнаруживается не только в месте инъекции, но и в голове рыбы, в частности в головном мозге, а также вдоль всего спинного мозга. В данном исследовании мы представляем два различных метода моделирования острой и хронической гипергликемии у zebrafish и демонстрируем, что гипергликемия нарушает пролиферацию клеток мозга как в нормальных условиях, так и при наличии повреждений.

В заключение следует отметить, что zebrafish могут быть использованы в качестве релевантной модели для исследования пагубных эффектов гипергликемии в центральной нервной системе. Данная модель также позволяет оценивать биораспределение радиомаркированных молекул с помощью ПЭТ-сканирования.