Универсальный способ крепления для Long Term Визуализация данио развития

Общая цель этого метода заключается в том, чтобы осаждать эмбрионы рыбок данио для визуализации в реальном времени, что обеспечивает нормальный рост задней части тела. Этот метод может быть адаптирован для визуализации других областей развивающейся рыбки данио. Этот метод помогает ответить на ключевые вопросы биологии развития, например, как поведение отдельных клеток приводит к морфогенезу на уровне целых тканей.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обеспечивает свободный момент задней части тела, сохраняя при этом эмбрион в правильной ориентации. Для начала добавьте агарозу с низкой температурой плавления в конечной концентрации 1,5% в среду Е3 в 50-миллилитровую пробирку и растворите агарозу путем нагревания в микроволновой печи. Дайте раствору уравновеситься до 42-45 градусов Цельсия на водяной бане или в настольном инкубаторе.

После вытягивание стекла иглами согласно текстовому протоколу. С помощью пары щипцов сломайте иглу сразу за точкой, где она сгибается, чтобы создать чистую и острую иглу для ориентации эмбрионов и удаления излишков агарозы. Вырастите эмбрионы до соответствующей стадии в среде Е3.

Затем под бинокулярным препарирующим микроскопом используйте пару острых щипцов для дехорионизации эмбрионов. Инкубируйте дехорионированные эмбрионы не менее пяти минут в рабочем растворе трикаина. Затем с помощью стеклянной пастеровской пипетки перенесите дехорионированный эмбрион с минимальным Е3 непосредственно в 50-миллилитровую пробирку с температурой 45 градусов Цельсия агарозой.

Извлеките зародыш вместе примерно с одним миллилитром монтажной агарозы и перенесите примерно 100 микролитров среды с зародышем в центр 10-миллиметровой микролунки на дне 35-миллиметровой чашки Петри со стеклянным дном. По мере того как среда для крепления схватывается, переместите эмбрион к краю круга агарозы хвостом наружу. Используйте капиллярную иглу, чтобы ориентировать эмбрион как можно латеральнее, чтобы визуализировать развитие задней части тела.

Затем с помощью капилляра поддерживайте эмбрион в желаемой боковой ориентации до полного схватывания геля. Как только капля агарозы застынет, используйте рабочий раствор трикаина, чтобы залить чашку Петри. Затем под рассекающим микроскопом с основанием из проходящего света отрегулируйте положение зеркала и угол падающего света таким образом, чтобы сильный контраст позволил четко увидеть срезы в агарозе.

Чтобы выполнить разрез один, используйте капиллярную иглу или микроскальпель, чтобы разрезать агарозу пилящими движениями вверх и вниз, рядом и посередине вдоль желтка, прямо позади формирующихся полей сердца вниз по пятому переднему сомиту и полностью через агарозу к стеклу. Здесь очень важно убедиться, что эмбрион не будет поврежден во время разрезания агарозы над желточным мешком. Затем сделайте второй и третий надрезы, начиная против эмбриона вниз к стеклу, по касательной к первым пяти сомитам, позволяя дорсальному раскрытию заднего тела.

Затем, начиная с пересечения первого и третьего разрезов, сделайте медленный диагональный разрез к концу третьего разреза, медленно поднимаясь вверх, чтобы сместить квадрат агарозы, окружающий заднюю часть тела. С помощью пары острых щипцов удалите выбитые блоки агарозы из эмбриональной среды, используя стенку чашки Петри в качестве опоры, при этом вынимая кусочки агарозы. Перед установкой образца используйте 1%-ную агарозу в E3, чтобы покрыть 100-миллиметровую пластиковую тарелку высотой до пяти миллиметров и дать ей застыть.

Затем капните каплю агарозы с низкой температурой плавления в один миллилитр в центр посуды и дайте ей также застыть. Поместите эмбрионы в агарозу с низкой температурой плавления, как было показано ранее в этом видео. Однако на этот раз извлеките эмбрион из 50-миллилитровой пробирки агарозы с меньшей каплей раствора и поместите эту маленькую каплю поверх одной миллилитровой капли в центре посуды.

С помощью капиллярной иглы расположите эмбрион в центре маленькой капли и сохраняйте его правильную ориентацию до тех пор, пока гель не застынет. Наконец, с помощью рабочего раствора трикаина залить посуду и удалить излишки агарозы. В этом анимационном видео показан пример эмбриона данио-рерио, которому ввели мРНК, кодирующую фотоконвертируемый флуоресцентный белок kikumeGR, а затем установили на 15-сомитную стадию и подвергли покадровой съемке в течение 12 часов.

Задняя часть тела может свободно двигаться и демонстрирует такие же изменения в морфологии, как и у эмбрионов, которым позволено развиваться без хориона в нормальных условиях культивирования. В этом видео эмбрионы были введены на 16-й клеточной стадии с мРНК, кодирующей гистон 2BRFP, который помечает ядра, и CAAXGFP, который помечает клеточные мембраны. Изображения были получены на вертикальном многофотонном микроскопе с 25-кратным объективом для погружения в воду из 10-сомитной стадии в течение трех часов для визуализации поведения клеток во время формирования хвостового зачатка.

Можно увидеть, как клетки генерируют активные выступы и направленные движения по мере того, как зачаток хвоста формируется нормально. После освоения этой техники ее можно выполнить за 20 минут, если все сделано правильно. Во время выполнения этой процедуры важно убедиться, что эмбрион находится в боковом положении во время схватывания агарозного геля.

В противном случае интересующая область будет быстро перемещаться из поля зрения во время визуализации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как монтировать эмбрионы данио-рерио для визуализации удлинения задней части тела в реальном времени.