Функциональная Манипуляция материнских генных продуктов с помощью In Vitro Созревание ооцитов в данио рерио

Общая цель этого протокола заключается в проведении in vitro созревания ооцитов рыб данио и, при желании, в функциональном манипулировании продуктами материнского гена до оплодотворения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, касающиеся важности материнского вклада в эмбрион. Основное преимущество этой методики заключается в культивировании ооцитов in vitro с последующим оплодотворением и получением жизнеспособных эмбрионов.

И, при желании, позволяет проводить функциональные манипуляции с продуктами материнского гена, которые действуют на ранних этапах развития эмбриона сразу после оплодотворения. Для начала, за восемь-10 дней до манипуляций с культурой in vitro, используйте сетку для переноса нескольких наборов одного самца и одной самки рыбы желаемого штамма в резервуар для спаривания. Оставьте их в сопрягаемом резервуаре на ночь.

После того, как рыбы смогут спариваться в течение следующего дня, используйте сетку, чтобы отделить самок, которые дают икру во время спаривания, и поместите их в отдельный аквариум. Кормите этих самок два раза в день пищевой смесью, содержащей примерно равное количество артемии, креветок и хлопьев корма для рыб. В стерильных условиях добавьте 20 миллилитров Leibovitz's L-15 Medium с L-глутамином, PH 7,0, в 50 миллилитровую коническую трубку.

Затем используйте 10 нормального гидроксида натрия, чтобы довести его до pH 9,0. Добавьте 9 миллилитров L-15 Medium в две отдельные 50-миллилитровые конические трубки. Затем пометьте одну пробирку DHP, а другую — DHP.

В пробирку DHP добавьте 10 микролитров DHP, 490 микролитров DH2O и 500 микролитров 10% BSA. В пробирку DHP добавьте 100 микролитров 10 мг на миллилитр гентамицина, 400 микролитров DH2O и 500 микролитров 10% BSA. Чтобы провести диссекцию ооцитов, начинают с приготовления 0,2%-ного раствора трикаина в DH2O, буферизованного до PH 7.0 с одним моляром триса PH 9.0.

Держите этот раствор на уровне 4 градусов по Цельсию. За ноль-четыре часа до окончания суточного светового цикла в помещении, в стакан объемом 250 миллилитров, добавьте 20 миллилитров 0,2%-ного раствора трикаина, PH 7,0, на 80 миллилитров рыбьей воды и перемешайте. Крайне важно начать процедуру в течение четырех часов после окончания светового цикла, к которому рыбы привыкли.

В противном случае ооциты не созреют должным образом. С помощью ложки соберите усыпленных рыб из раствора трикаина, и кратковременно промойте их в рыбьей воде. Затем выложите рыбу на бумажное полотенце, чтобы она впитала лишнюю воду.

Используйте чистое лезвие бритвы, чтобы обезглавить усыпленную рыбу на уровне грудного плавника. Затем ножницами для препарирования делают продольный надрез на брюшной стороне рыбы, проходящий от переднего конца к анальной области. Поместите рыбу на чашку Петри под препарирующий микроскоп с падающим светом.

Затем, используя пару препарирующих щипцов, изолируйте части яичников и перенесите ткань в культуральную чашку размером 35 на 10 миллиметров, содержащую четыре миллилитра L-15 Meidum Лейбовица, DHP. Теперь с помощью рассекающих щипцов аккуратно отделите ооциты от фолликулярной массы. Отсортируйте четыре ооцита на ранней стадии, которые имеют почти максимальный размер и характеризуются темной непрозрачной цитоплазмой и легко заметным зародышевым пузырьком, или GV, расположенным асимметрично внутри ооцита.

Отбрасывайте яйцеклетки на более ранних стадиях, и полупрозрачные зрелые яйцеклетки 5 стадии. С помощью стеклянной пастбищной пипетки перенесите четыре ооцита на ранней стадии во вторую пластиковую чашку для культуры размером 35 на 10 миллиметров, содержащую четыре миллилитра L-15 Medium Лейбовица плюс DHP. Перелейте минимальное количество среды минус DHP в тарелку, содержащую раствор плюс DHP.

При введении мРНК непосредственно перед инъекцией используйте РНК-воду обратного осмоса и 0,2 моляра хлорида калия, чтобы разбавить мРНК до конечного раствора 0,1 молярного хлорида калия. При введении морфолино или МО непосредственно перед инъекцией разбавьте МО до желаемой концентрации, используя воду обратного осмоса класса РНК и 0,2 моляра хлорида калия, чтобы достичь конечной концентрации 0,1 молярного хлорида калия. Затем, чтобы провести инъекцию, вручную удерживают ооциты тонкими щипцами и, используя иглу, сделанную из вытянутой стеклянной капиллярной пипетки, вводят примерно один нанолитр в ооциты четвертого стадия дикого типа.

Продолжайте инкубацию незрелых и введенных ооцитов в среде DHP при температуре 26,5 градусов Цельсия. Проверка примерно каждые 30 минут, чтобы убедиться, что ооциты остаются неповрежденными и претерпевают надлежащее созревание, становясь все более прозрачными. Используйте пастбищную пипетку для удаления лизирующих ооцитов.

И выбросьте их в стакан для лабораторных отходов, чтобы сохранить качество среды. Используя примерно половину объема свежей среды DHP, замените питательную среду для поддержания прозрачного раствора, в зависимости от количества лизиса ооцитов. Когда большинство ооцитов стали полупрозрачными и имеют ГВ, которая больше не проявляется, используйте очень тонкие щипцы для создания разрыва фолликулярной мембраны, в области с увеличенным пространством между ооцитом и мембраной.

Снимите часть мембраны и, удерживая очищенную часть, скатайте ооцит из мембраны. Еще одним важным этапом является удаление фолликулярной оболочки. Если этот слой не будет полностью удален, оплодотворение и расширение хориона будут затруднены.

Перенесите дефолликулированные ооциты в минимальном объеме среды, в чашку Петри с несколькими каплями питательной среды DHP, и приступайте к оплодотворению. Ближе к концу этапа созревания ооцитов и перед дефолликуляцией приготовьте раствор сперматозоида с использованием яичек пяти самцов в 500 микролитрах раствора Хэнка. Добавьте от 10 до 50 микролитров сперматозоидного раствора к дефолликулированным ооцитам в культуральной среде DHP.

Затем подождите 10 секунд. С помощью пипетки добавьте к ооцитам несколько капель среды Е3. Подождите одну минуту, а затем используйте среду E3, чтобы залить пластину.

После того, как оплодотворенные эмбрионы развились, используйте препарирующий микроскоп с оптикой проходящего света для наблюдения за прогрессией на этапах расщепления, чтобы обеспечить успешное оплодотворение, как описано ранее для оплодотворения и стадии. Как видно из экспрессии GFP, ооциты из культуры in vitro способны продуцировать белок из экзогенной мРНК на протяжении всего развития ооцитов всего за два часа. Однако только ооциты, которые инициируют условия культивирования на четвертой стадии оогенеза, могут развиться в зрелые ооциты пятой стадии.

В этом эксперименте введенная мРНК полярного сияния дикого типа спасает фенотипические эффекты мутации в соответствующем гене, клеточном острове. Эмбрионам из контрольной группы также позволяют развиваться, чтобы показать соответствующий мутантный фенотип. Инъекция блокирующего трансляцию морфолино может успешно фенокопировать известный мутантный фенотип, о чем свидетельствует инъекция lrmp-MO в ооциты, которая имитирует мутантный фенотип соответствующего бесполезного цикла мутаций.

Кодирующая мРНК также может быть введена в ооциты дикого типа или мутантные ооциты для визуализации соответствующих продуктов в раннем эмбрионе. Например, как видно на рисунке, белок Sass6-mCherry локализуется в очагах, меченных центросомным маркером гамма-тубулином. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за 5-6 часов, если она выполнена правильно.

Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить, что не следует торопиться с процедурой и обеспечить надлежащее созревание ооцитов перед дефолликуляцией и оплодотворением. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как фиксация эмбрионов, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Например, спасение интересующего вас гена или локализация РНК или белка.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области раннего эмбрионогенеза для изучения вклада продуктов материнского гена в рыбок данио. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как функционально манипулировать продуктами материнского гена посредством созревания in vitro ооцитов рыб данио.