Подготовка и наблюдение Толстые биологических образцов с помощью сканирующего трансмиссионной электронной томографии

Общей целью данной процедуры является получение трехмерной реконструкции с восстановлением глубины резкости толстого биологического образца с помощью сканирующей просвечивающей электронной томографии с конвергентным пучком. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области структурной биологии об электронной томографии толстых биологических образцов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что изображения могут быть получены в сходящемся битовом режиме, а обработка данных может быть выполнена в большинстве программ, предназначенных для томографии.

Чтобы начать подготовку образца для клеточной культуры, центрифугируйте образец при давлении 5000 x g в течение пяти минут. Используйте эти параметры центрифугирования во время подготовки образцов. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре PBS, обогащенном 4% параформальдегида и 2% глутеральдегида.

Выдержать суспензию в течение 30 минут при комнатной температуре. Центрифугируйте смесь, выбросьте надосадочную жидкость и трижды промойте гранулу одной миллилитровой порцией PBS. Используя те же условия инкубации и процедуру промывки, инкубируйте гранулу в одном миллилитре PBS, обогащенном 1%-ным тетраоксидом осмия, и в одном миллилитре PBS, обогащенном 2%-ным уранилацетатом.

Далее охладите образец до четырех градусов по Цельсию. Обезвоживайте гранулы путем последовательной инкубации во все более концентрированных растворах этанола. Поддержание температуры образца на уровне четырех градусов Цельсия на протяжении всей инкубации, центрифугирования и промывки.

Ресуспендируйте обезвоженную гранулу в одном миллилитре чистого этанола и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия. Затем дайте образцу нагреться до комнатной температуры и центрифугируйте образец. Инкубируйте гранулу во все более концентрированных растворах эпоксидных смол при комнатной температуре.

После окончательной промывки повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре чистой эпоксидной смолы, и выдержите в течение ночи при комнатной температуре. Центрифугируйте образец, и удалите надосадочную жидкость, а затем повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах эпоксидной смолы и отвердителя. Переложите суспензию в капсулу.

Инкубируйте пластиковую капсулу при температуре 60 градусов Цельсия в течение 48 часов, чтобы смола полимеризовалась. Извлеките капсулу из инкубатора и проверьте полимеризацию смолы. Добавьте слой эпоксидной смолы и отвердителя поверх внедренного образца и снова инкубируйте капсулу в тех же условиях.

Закрепите образец, залитый смолой, вверх ногами в держателе образца. Надежно зафиксируйте образец на обрезном блоке ультрамикротома. Отрежьте пластиковую капсулу от образца в смоле.

Сформируйте из обнаженной смолы пирамиду. Затем перенесите капсулу и держатель образца на движущийся рычаг ультрамикротома. Установите обрезной нож и, ориентируясь на микроскоп, доработайте форму пирамиды.

Замените обрезной нож на гистологический нож. Под микроскопом отрегулируйте угол наклона капсулы так, чтобы пирамида была перпендикулярна краю ножа. Установите скорость резки и разделите образец.

После среза образца перенесите выбранный срез на обработанную медную сетку поверх фильтровальной бумаги. Дайте образцу высохнуть, а затем загрузите образец в электронный микроскоп. Чтобы спроектировать ряд наклонов сквозного фокуса, сначала рассчитайте глубину резкости электронного пучка и максимальную видимую толщину образца.

На основе этих значений выберите интервал фокусировки и определите количество шагов фокусировки, необходимых для получения изображения всего образца с максимальной видимой толщиной. Затем при малом увеличении найдите интересующую область внутри образца. Отрегулируйте высоту эуцентрика таким образом, чтобы ROI не казался движущимся при вращении образца.

Убедитесь, что ROI остается видимым во всем диапазоне наклона. Заполните параметры серии сквозного фокусного наклона для автоматического сбора изображений и получения изображений. Импортируйте серию изображений в программу обработки изображений и выровняйте собранные изображения под одинаковым углом наклона в пирамидальной иерархии.

Найдите выравнивание под каждым углом наклона, сложив выровненные изображения. Просмотрите стек, чтобы убедиться, что от изображения к изображению перемещается только выделенная область, и при необходимости выровняйте изображения. После проверки юстировки по всему образцу объедините информацию в фокусе на высоких настройках, чтобы получить серию с одним изображением на каждый угол наклона.

Выполнение выравнивания ряда наклонов на основе локальных минимумов или реперных маркеров. Выполните 3-D реконструкцию и осмотрите полученное изображение. Если реконструкция выглядит размытой или деформированной, повторно выровняйте исходный ряд изображений.

Образец t. brucei был визуализирован и проанализирован с использованием этого метода. При нулевом угле наклона видны несколько деталей жгутикового кармана.

При более высоком угле наклона (70 градусов) в фокусе находится только часть каждого изображения, собранного в сквозном фокальном ряду. Эта позиция меняется на протяжении всего сериала. Путем объединения секций в фокусе создается одно изображение с большей зоной фокусировки.

Этот эффект становится еще более выраженным, когда выделяются высокочастотные области серии сквозного фокального наклона. Высокочастотная информация охватывает большую часть объединенного изображения, что указывает на то, что ряд наклона сквозного фокуса был обработан хорошо. После освоения часть обработки изображения может быть выполнена примерно за три-четыре часа, в зависимости от выбранных параметров выравнивания и реконструкции.

При проведении этой процедуры важно помнить, что качество окончательной реконструкции во многом зависит от качества предыдущих тестов на выравнивание. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выполнять сбор и обработку изображений серии с сквозным фокусным наклоном.