Визуализация белокбелковых взаимодействия в ядерной и цитоплазматических фракций Co-иммунопреципитации и В Ситу Пробирной Расстояние Лигирование

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы сравнить преимущества и недостатки ко-иммунопреципитации (co-ip) и анализа близкого лигирования (pla) в визуализации белковых взаимодействий в различных клетках. Представленное здесь сравнение двух различных методов может помочь ученым решить, какой из них лучше подходит для их конкретной цели при исследовании закономерностей распределения белковых белковых взаимодействий в ядре и цитоплазме клетки. Основное преимущество co-ip заключается в обнаружении подлинных белковых взаимодействий.

В отличие от этого, преимущество pla заключается в том, что он позволяет быстро анализировать белковые взаимодействия института на уровне одной клетки. После выращивания и забора гекс293 клеток согласно текстовому протоколу, в 3 раза по 10 к 6-м клеткам, добавьте 300 микролитров холодного раствора цитоплазматической экстракции, и сделайте вихревыми движениями клетки с максимальной скоростью в течение 15 секунд. Инкубируйте экстракт на льду в течение 30 минут, а каждые 10 минут в течение инкубации делайте образец вихревым путем в течение пяти секунд.

Затем добавьте 16,5 микролитров холодного раствора цитоплазматической экстракции, встряхните в течение пяти секунд и инкубируйте образец на льду в течение пяти минут. Ввергните экстракт в вихрь в течение пяти секунд и центрифугируйте образец при 16 000 x g и 4 градусах Цельсия в течение пяти минут. Переложите надосадочную жидкость в новую предварительно охлажденную пробирку и держите ее на льду до использования, затем используйте один миллилитр холодной PBS для трехкратной промывки нерастворимых гранул, пипетируя вверх и вниз и удаляя PBS после каждой промывки.

Далее добавьте 150 микролитров холодного раствора для ядерной экстракции, сделайте вихрь в течение 15 секунд и инкубируйте на льду в течение одного часа. Каждые 10 минут во время инкубации перебивайте образец вихрем в течение 15 секунд и с помощью наконечника объемом 200 микролитров пипетируйте раствор 10 раз. Нанесите вихревую жидкость на пробирку на 15 секунд и центрифугируйте образец при температуре 16 000 x g при 4 градусах Цельсия в течение 10 минут, затем переложите надосадочную жидкость, содержащую ядерный экстракт, в новую предварительно охлажденную пробирку и держите ее на льду до использования.

Удалите по 10% объема ядерных и цитоплазматических экстрактов в качестве входных данных, затем добавьте холодный PBS к оставшимся экстрактам до конечного объема в один миллилитр. Держите на льду до использования. После предварительного очищения конъюгированных магнитных шариков белка g при необходимости соедините 40 микролитров конъюгированных магнитных шариков белка g с четырьмя микрограммами быстрого поликлонального антитела против RBM3 или быстрого IGG в качестве отрицательного контроля в 200 микролитрах PBST.

Инкубировать до комнатной температуры на ротатере в течение 40 минут. Поместите пробирки на магнитный штатив, затем извлеките и выбросьте надосадочную жидкость. Затем 200 микролитрами PBST промыть бусины один раз.

Добавьте в бусины один миллилитр разведенных лизатов, и выдержите на ротаторе при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день поместите трубки на магнитный штатив и аспирируйте надосадочную жидкость. Добавьте 0,5 миллилитра PBST в бусины и промойте их три раза на ротаторе при четырех градусах Цельсия, с фиксированной скоростью 20 оборотов в минуту в течение 10 минут.

Выведите белок из гранул, добавив 40 микролитров буфера для образца, затем нагрейте образец до 70 градусов Цельсия в течение 10 минут. После закручивания бусин переложите жидкость в новую 1,5-миллилитровую трубку. Для проведения иммуноцитарной химии засейте клетки HEK293 в соотношении 1,5 умножить на 10 до четырех клеток на камеру в восьмикамерном предметном стекле, покрытом полиделизином.

В 0,4 миллилитра ДМЭМ дополнено 10% FPS и 100 единиц на миллилитр пенстрептокка. Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе в течение 48 часов, затем аспирируйте среду и используйте 4% PFA для фиксации клеток при комнатной температуре в течение 10 минут в ламинарном проточном колпаке. Затем аспирируйте PFA и используйте 0,5 миллилитра PBS на камеру, чтобы промыть клетки три раза.

Добавьте 0,5% tritonX100 с 5% NGS и PBS для проникновения и блокировки клеток и инкубации при комнатной температуре в течение одного часа. Затем, после разбавления моноклональных антител против NF90 и поликлональных антител против RBM3 от одного до 100, добавьте первичные антитела в лунки и инкубируйте на шейкере при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день используйте 0,5 миллилитра PBS для промывки камер три раза по 10 минут каждая.

Чтобы провести иммуноцитарную химию, добавьте в клетки один к 500 разведение антимышиных антител с зеленым флуоресцентным красителем и антикроличьих антител, связанных с красным флуоресцентным красителем, и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа. Добавьте от одного до 5000 разведения DAPHE NBPS для противостояния ядрам и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут, затем промойте образцы PBS, как и раньше. Снимите камеры со стеклянного предметного стекла и просушите их, прежде чем использовать 250 микролитров монтажного материала на одно предметное стекло для их монтажа.

Для получения зондов для анализа бесконтактного лигирования пробирки, после инкубации клеток и первичных антител и промывки, как только что показано, разбавьте предварительно изготовленные зонды от одного до 5 в 0,1% тритонх100 и 5% NGS и PBS, в общем объеме 320 микролитров для одного восьмикамерного предметного стекла. Инкубируйте раствор при комнатной температуре в течение 20 минут. Снимите камеры со стеклянной стороны и добавьте разведенные зонды, затем инкубируйте камеры в инкубаторе с влажностью при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.

Приготовьте раствор для лигирования, смешав восемь микролитров лигазы, 64 микролитра 5-кратного лигационного запаса и 248 микролитров воды. Стряхните жидкость со стекла и используйте буфер промывки Onex A для промывки образцов дважды по пять минут каждый. Добавьте раствор для лигирования к образцам, и инкубируйте их в инкубаторе с влажностью при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Приготовьте раствор для амплификации, смешав четыре микролитра полимеразы, 64 микролитра 5-кратного амплификатора и 252 микролитра воды, и оберните трубку фольгой, чтобы защитить ее от света. Затем стряхните жидкость со предметного стекла и используйте один буфер для промывки А, чтобы дважды промыть образцы по две минуты каждый. Добавьте раствор для амплификации к образцам и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в темном влажном инкубаторе в течение 100 минут.

Затем, после вытекания жидкости, как и раньше, промойте образцы дважды по 10 минут каждый в буфере для промывки B, а затем промойте их один раз в 0,1 x буфере для промывки B. Наконец, высушите предметное стекло и установите образцы с 250 микролитрами коммерческой монтажной среды с DAPHE, изучите флуоресценцию под микроскопом и получите изображения с помощью ПЗС-камеры. Эксперименты по совместной иммунопреципитации с RBM3 в качестве белка-приманки показали, что взаимодействия NF90-RBM3 преимущественно присутствуют в ядре, а меньшинство обнаруживается в цитоплазме. В этом эксперименте с иммунофлуоресценцией NF90 и RBM3 наблюдаются в ядре.

Оба белка также находятся в цитоплазме в С2, и оба белка демонстрируют идеальную колокализацию в каждом компартменте. Как видно на этих изображениях, анализ близкого лигирования выявил картину взаимодействий NF90-RBM3, которая очень похожа на традиционную иммуноцитарную химию, которая чаще всего взаимодействует в ядре большинства клеток. Лишь небольшая часть клеток продемонстрировала преимущественно цитоплазматическое распределение взаимодействий NF90-RBM3.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что, хотя PLA и более удобен, он не отражает взаимодействия белковых белков напрямую. Вместо этого co-ip обнаруживает направленное взаимодействие. Кроме того, специфичность первичного антитела определяет качество результата.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выбрать подходящий метод изучения белковых взаимодействий в различных клеточных компартментах в соответствии с вашей собственной экспериментальной целью.