Одноклеточный экспрессии генов профилирование с помощью FACS и КПЦР с внутренними стандартами

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке уровней мРНК в отдельных клетках с помощью микрофлюидной количественной ПЦР с внутренними стандартами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии одиночных клеток, например, реагируют ли клеточные популяции клеток на стимул характерно по-разному. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он может измерять экспрессию большего количества генов, чем РНК FISH, при меньших затратах, чем RNA-Seq в отдельных клетках.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы изучали протоколы измерения экспрессии генов в отдельных клетках с помощью микрофлюидной количественной ПЦР. Мы хотели модифицировать существующие методы для более точной оценки абсолютного числа различных транскриптов в отдельных клетках. Демонстрировать процедуру сортировки клеток будет Уильям Телфорд (William Telford), менеджер установки проточной цитометрии, используемой в моей лаборатории.

После получения и очистки ампликонов из интересующих генов в соответствии с текстовым протоколом соедините по 18 микролитров каждого очищенного ампликона в микроцентрифужной пробирке объемом 2,0 миллилитров с низкой связываемостью, затем добавьте буфер суспензии ДНК до 1800 микролитров так, чтобы концентрация каждого ампликона была от пяти до 10 до шестой молекулы на микролитр. Тщательно перебейте стандарт 5е6 и разделите его на 20 микролитров аликвот в ПЦР-пробирках с низкой связываемостью. После осаждения клеток MCF7 p53-Venus в соответствии с текстовым протоколом добавьте в клетки 400 нанограммов неокарциностатина на миллилитр и обрабатывайте их в течение трех, 8,5, 14 или 24 часов.

Чтобы сделать буфер для лизиса, объедините реагенты, перечисленные в этой таблице. Перелейте 92,4 микролитра буфера в отдельную пробирку, которая будет служить буфером для лизиса для стандартов ампликона. Оставшийся буфер для лизиса будет предназначен для клеток.

Приготовьте и добавьте ДНК E.coli в буфер для лизиса клеток, в соответствии с текстовым протоколом. Для подготовки стандартов промаркируйте шесть пробирок центрифуг с низким уровнем связывания. Добавьте в пробирку 90 микролитров суспензионного буфера ДНК 5e5.

Добавьте 90 микролитров буфера, содержащего 6,2 пикограмма на микролитр ДНК E.coli, в каждую из остальных пяти пробирок и держите все пробирки на льду. После извлечения аликвоты стандарта 5е6 из хранилища кратковременно закрутите пробирку, затем закрутите ее, чтобы жидкость оказалась на дне пробирки, затем с помощью наконечника пипетки с низким связыванием добавьте 10 микролитров стандарта 5е6 в пробирку 5е5. Сделайте вихрь, раскрутите и поставьте трубку обратно на лед.

Затем нанесите пипетку на 10 микролитров из пробирки 5e5 в пробирку 5e4, затем кратковременно закрутите трубку, раскрутите ее и снова положите трубку на лед. Повторяйте последовательные разведения с каждой пробиркой, получая по 10 микролитров из предыдущей пробирки до тех пор, пока все пробирки не получат разведение стандартное. После приготовления ПЦР-пробирок с буфером для лизиса, с помощью 12-канальной пипетки распределите девять микролитров буфера для лизиса клеток из ряда ПЦР-пробирок в каждую лунку первых семи рядов ПЦР-планшета.

Распределите семь микролитров стандартного буфера для лизиса в каждую лунку последнего ряда планшета, затем с помощью наконечников пипеток с низким связыванием добавьте два микролитра стандартного в каждую лунку нижнего ряда в соответствии с картой планшета. Добавьте два микролитра по 3,1 пикограмма на микролитр ДНК E.coli в 10 клеточных и 100 клеточных лунок, затем добавьте два микролитра по 6,2 пикограмма на микролитр ДНК E.coli в неклеточные лунки. После программирования сортировщика с флуоресцентными активируемыми клетками для сортировки в 96-луночную пластину в соответствии с картой планшетов, навести машину, запечатать пустую ПЦР-пластину и использовать тестовый поток для сортировки капель и PBS на пломбе пустой пластины.

Если капли не приземляются в правильном положении, сотрите их с поверхности уплотнения, повторно откалибруйте сортировщик ячеек в соответствии с инструкциями производителя машины и повторяйте до тех пор, пока капли в потоке сортировки не будут нанесены правильно. Соберите клетки методом трипсинизации и повторно суспендируйте их в 0,5 миллилитрах PBS с 2% FBS, затем перенесите в пробирку проточной цитометрии. Чтобы отсортировать клетки, вставьте трубку с клеточной суспензией в клеточный сортировщик, откройте пломбу на пластине буфера для лизиса и тщательно отсортируйте интересующие клетки в пластину в соответствии с картой пластины.

Чтобы обеспечить максимальную чистоту отдельных клеток, запустите машину в одноклеточном режиме и используйте стандартное стробирование проточной цитометрии на основе прямого и бокового рассеяния. После прогона используйте новый стерильный термический шов для герметизации пластины и центрифугируйте ее при 400-кратном g в течение четырех градусов Цельсия в течение одной минуты, затем поместите пластину в термоамплификатор и запустите ранее подготовленную программу RT-STA. После вращения готового планшета RT-STA с помощью 12-канальной пипетки распределите 3,6 микролитра разбавленной экзонуклеазы I в каждую лунку планшета.

Запечатайте и кратковременно вращайте пластину, затем поместите пластину в термоамплификатор и запустите программу exo I. Чтобы измерить экспрессию генов домашнего хозяйства в каждом образце, приготовьте 900 микролитров мастер-смеси ДНК-связывающего красителя для qPCR для 96 реакций с использованием праймеров из одного из выбранных генов домашнего хозяйства. Распределите девять микролитров мастер-смеси по каждой лунке 96-луночного ПЦР-планшета, затем добавьте один микролитр образца из образца планшета в соответствующую лунку ПЦР-планшета.

Запустите планшет на ПЦР-машине в реальном времени, используя протокол термоциклирования, предложенный производителем мастер-смеси, или следуя стандартному протоколу, затем проанализируйте образцы и составьте карту планшетов для образцовых смесей в соответствии с текстовым протоколом. Пометьте смесь образцов на планшете, а затем с помощью восьмиканальной пипетки распределите 3,3 микролитра смеси образца реагентной загрузки в каждую лунку 96-луночного планшета для ПЦР. Для каждой ПЦР-планшета с образцами сделайте вихревую пластину в течение 10 секунд и вращайте ее со скоростью 500 g в течение 10 секунд.

Снимите крышку и перенесите 2,7 микролитра каждого положительного образца одной клетки в соответствующую лунку на планшете для образцовых смесей для лунок с одной клеткой, указанных на карте планшета. Снимите наклейку с нижней части нового микрофлюидного чипа для количественной ПЦР, затем с помощью шприца с жидкостью контрольной линии с неподвижным колпачком нажмите на каждую пружину аккумулятора, чтобы ослабить ее, и введите в каждый аккумулятор от 100 до 200 микролитров жидкости для контрольной линии. Вставьте чип в загрузочную машину и запустите основной скрипт, затем с помощью восьмиканальной пипетки перенесите 4,5 микролитра каждой смеси для анализа в левую часть микрофлюидного чипа для количественной ПЦР.

Очень важно избегать образования пузырьков воздуха на дне скважин. Это создаст проблемы с загрузкой. Чтобы этого не допустить, прикасайтесь кончиками пипетки к боковой стороне лунки, затем проводите пипетку только до первого упора.

Перенесите 4,5 микролитра каждой смеси образцов на правую сторону микрофлюидного чипа для количественной ПЦР, затем вставьте чип в загрузочную машину и запустите скрипт загрузки смеси. Когда сценарий смешивания нагрузки будет завершен, убедитесь, что на чипе нет линий, которые указывали бы на проблему с загрузкой, затем используйте ленту для тщательного удаления частиц пыли с чипа, затем вставьте чип в микрофлюидную машину для ПЦР в реальном времени и запустите скрипт сбора данных. Наконец, проанализируйте данные в соответствии с текстовым протоколом.

На этом рисунке показаны уровни экспрессии гена, измеренные с помощью количественной ПЦР, чтобы определить, в какие лунки попала одна клетка. Образцы, получившие клетку, имеют низкие значения КТ. Образцы без клетки имеют гораздо более высокие значения КТ.

Лунки для стандарта ампликона должны показывать равномерно расположенные кривые усиления. Также должно быть четкое разделение на кривых для нуклеотидных, 10-ячеистых и 100-ячеистых ячеек. Образцы ДНК семян, представляющие собой реальные клетки, отбираются из нескольких отсортированных 96-луночных планшетов и объединяются в одной пластине для подготовки к микрофлюидной количественной ПЦР.

Эта тепловая карта обобщает результаты микрофлюидной количественной ПЦР. Цветовая вариация в каждом столбце показывает вариабельность экспрессии каждого гена между различными клетками. Два ряда, которые намного темнее остальных, скорее всего, представляют собой плохие образцы.

При попытке выполнить эту процедуру важно сохранить свободную РНКазу и ДНК в рабочей зоне, особенно при создании буфера для стандартов и лизиса. Части этого протокола, предшествующие ПЦР, чувствительны к загрязнению. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как количественно оценить экспрессию нескольких генов, представляющих интерес в отдельных клетках.

После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как одномолекулярная РНК FISH, для проверки измерений распространенности мРНК в отдельных клетках.