3D Magnetic Stem Cell Aggregation и биореактор Созревание для регенерации хряща

Общей целью этого метода магнитной агрегации клеток и динамического созревания является улучшение in vitro хондрогенеза мезенхимальных стромальных клеток или МСК. Магнитная агрегация стволовых клеток вместо хондрогенеза в виде конденсации клеток является ранним ключевым этапом процесса регенерации хряща. После того, как стволовые клетки заключены в каркасы, скаффолды могут быть перемещены в клеточный биореактор для оценки динамического созревания клеток.

Важный метод динамики может быть применен к другим биосистемам, таким как мышечная, сердечная или сосудистая коррекция. Но, как вы увидите, он очень хорошо подходит для регенерации хряща. Визуальная демонстрация магнитного посева клеток и динамического созревания клеток с использованием реального биореактора имеет решающее значение, поскольку эти два метода трудно изучить только с помощью текстовых инструкций.

Чтобы сконструировать микромагнитное устройство для формирования заполнителя, сначала вставьте магнитный наконечник диаметром 750 микрометров в каждое трехсантиметровое отверстие в алюминиевой пластине толщиной шесть миллиметров и поместите пластину на постоянный неодимовый магнит. Чтобы сконструировать устройство для засева лесов, сначала разрежьте твердый полистирол на квадраты площадью 2,4 квадратных сантиметра и вставьте магниты диаметром три миллиметра и шесть миллиметров на равном расстоянии на поверхность площадью 1,6 квадратного сантиметра. Затем поместите устройство на постоянный неодимовый магнит.

Чтобы пометить человеческие МСК, сначала культивируйте стволовые клетки в полной питательной среде МСК при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до тех пор, пока они не станут слитыми на 90%. Отсадите, а затем промойте клетки сывороткой трех RPMI средой без глютамина и добавьте 10 миллилитров раствора наночастиц оксида железа на 150 квадратных сантиметровых колб для культуры для 30-минутной инкубации в инкубаторе для клеточных культур. В конце инкубации промойте клетки в течение пяти минут сывороткой со средой трех RPMI без глутамина, чтобы усвоить наночастицы, все еще прикрепленные к плазматической мембране.

Затем замените RPMI в каждой колбе 25 миллилитрами полной питательной среды MSC и верните клетки в инкубатор для клеточных культур на ночь. На следующее утро отделите магнитные элементы восемью миллилитрами 05% трипсина-ЭДТА в колбе. И собрать диссоциированные клетки методом центрифугирования.

Подвешиваем гранулы для подсчета и помещаем стеклянное дно 35 миллиметровой клеточной культуры в чашку Петри сверху каждого магнитного устройства. Для магнитного формирования агрегатов добавьте в каждую чашку Петри по три миллилитра хондрогенной среды и аккуратно внесите не более восьми микролитров в 2,5 раза по 10 на 5-ю меченые ячейки на один агрегат. Очень важно, чтобы клетки откладывались не слишком медленно и не слишком быстро.

И не слишком близко и не слишком далеко от магнетизма. Когда все агрегаты будут размещены, дайте сфероидам образоваться в течение 20-30 минут без помех. Затем переложите агрегаты в инкубатор для клеточных культур.

В тот же день сформировать агрегаты путем центрифугирования 2,5 раза по 10 до 5-го меченых стволовых клеток в конических пробирках объемом 15 миллилитров с 1,5 миллилитровыми хондрогенными средами. Для магнитного засеменения каркасов помещают по одному высушенному пуллулан/декстрановому полисахаридному пористому каркасу в чашку Петри и разводят в 2 раза по 10-6-ю меченые клетки в 350 микролитрах хондрогенной среды без TGFbeta3. Осторожно наведите клетки пипеткой на каркасы и инкубируйте структуры при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы обеспечить полное проникновение клеток.

Через пять минут осторожно добавьте три миллилитра хондрогенной среды в чашку Петри и верните каркасы в инкубатор для клеточных культур на четыре дня, чтобы позволить клеткам мигрировать через поры каркаса. В тот же день также засейте еще один набор скаффолдов с 2 раза по 10 до 6-й меченых стволовых клеток, как показано на рисунке, и инкубируйте клетки без магнита для получения равномерно засеянных скаффолдов в качестве положительного контроля. Для хондрогенеза в скаффолды на 5-й день удалите магнитное устройство со всех скаффолдов и верните статические скаффолды в инкубатор для клеточных культур до 25-го дня, меняя среду два раза в неделю.

Для динамической клеточной культуры также на пятый день отрежьте силиконовые трубки до соответствующей длины в соответствии с инструкциями производителя и переместите трубки, камеру для культуры на 500 миллилитров, двухсторонние ротаторы и клетки в стерильную станцию микробиологической безопасности. Следуя инструкциям производителя, подключите трубку к двусторонним вращателям в камере для культивирования. Затем с помощью стерильного шпателя аккуратно перенесите два клеточных каркаса в каждую клетку.

Когда все каркасы будут перенесены, вставьте клетки через иглы в крышку, чтобы они не двигались во время вращения. И заполните камеру культуры хондрогенной средой. Используйте стерильную антисептическую технику при подготовке камер, чтобы избежать загрязнения любого из инструментов или лесов.

Далее вставьте клетки в камеру, а затем закройте камеру и включите перистальтический насос, чтобы заполнить трубку хондрогенной средой и устранить пузырьки воздуха. Поместите и закрепите заполненную камеру внутри двигателя биореактора и включите компьютер, который управляет вращением манипулятора и камеры. Затем примените скорость вращения пять оборотов в минуту к манипулятору и камере и отрегулируйте перистальтический насос на скорость потока 10 оборотов в минуту для непрерывной подачи ячеистых каркасов.

Чтобы создать конструкцию 3D агрегата без скаффолда, на восьмой день инициируйте слияние, поместив два агрегата в контакт в хондрогенной среде до восьми дублей. Затем на 11-й день объедините два четверных, чтобы сформировать четыре четверняшки, и сформируйте окончательную структуру на 15-й день, соединив четыре четверки. Ткани, полученные в результате магнитного синтеза, демонстрируют значительное увеличение экспрессии коллагена II по сравнению с гранулами, полученными центрифугированием.

С повышенным трендом на агрегантное выражение. Для целлюляризованных статических скаффолдов наблюдается увеличение экспрессии агреганта и коллагена II при использовании магнитного посева, по сравнению с каркасом, затравленным без магнитных сил. Интересно, что экспрессия коллагена II намного выше, когда магнитное затравливание сочетается с динамической дифференцировкой.

Гистологический анализ с использованием толуидинового синего показывает, что последовательное магнитное слияние 16 агрегатов демонстрирует обильное отложение глюкозаминовых гликанов. Кроме того, в каркасах с магнитным посевом содержание глюкозаминагликана выше при дифференцировке каркасов в биореакторе, чем при их статическом культивировании. После освоения агрегация магнитных элементов может быть завершена за два часа, если все выполнено правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о ресуспендии меченых клеток в как можно меньшем объеме, чтобы облегчить образование агрегатов. После магнитного посева каркасов может быть выполнено динамическое созревание с использованием собственно биореактора для улучшения экспрессии новых синтезированных хондроцитов. С момента своего развития этот метод проложил путь исследователям в области регенеративной медицины к изучению регенерации суставного хряща у человека.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как конструировать магнитные устройства, мечить стволовые клетки из агрегатов стволовых клеток, магнитно засеивать каркасы и использовать настоящий биореактор. Не забывайте, что работа с клетками и тканями человека может быть чрезвычайно опасной, и что всегда следует принимать меры предосторожности, такие как ношение перчаток, лабораторных халатов и защитных очков.