Количественное определение поведения дрозофилы

Общая цель данного метода — измерить поведение Drosophila по уходу за телом (груминг) путем количественного определения и сравнения остатков окрашивающего ярко-желтого красителя на теле животных в условиях с грумингом и без него. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии и поведенческой генетики, такие как координация тонких локомоторных навыков, а также связанные с ними молекулярные регуляторы и нейронные цепи. Основными преимуществами данной техники являются ее быстрота, надежность и простота выполнения многими исследователями и студентами с разным уровнем подготовки.

Эту процедуру продемонстрирует Фрэнки Баррадейл, студент моей лаборатории. Для начала эксперимента подготовьте аспиратор, чтобы перенести живых Drosophila из культурального флакона в камеру для груминга. С помощью ножниц отрежьте 1.5 feet трубки Tygon.

Отрежьте примерно 2,5 см от кончика одноразового наконечника микропипетки объемом 1 мл и приложите кусочек сетки размером 1 см² к отверстию отрезанного наконечника. Плотно наденьте новый наконечник микропипетки объемом 1 мл поверх сетки и отрезанного кончика, чтобы создать камеру для содержания мух. Отрежьте самый кончик нового наконечника микропипетки, чтобы расширить отверстие до размера, позволяющего пройти одной мухе.

Отверстие должно примерно соответствовать проему камеры для груминга. Плотно наденьте вложенные наконечники на конец трубки Tygon. Вставьте наконечники в трубку, чтобы обеспечить герметичное соединение для создания вакуума.

На другом конце трубки обрежьте кончик наконечника микропипетки на 200 мкл и вставьте узкий обрезанный конец в трубку, чтобы сформировать заборную часть аспиратора. Для подготовки пробирок с аликвотами пыли отвесьте 5 мг ярко-желтого красителя на бумаге для взвешивания. Пересыпьте порошок в микроцентрифужную пробирку объемом 8 мл и плотно закройте крышку.

Затем для подготовки пробирок с этанолом перенесите 1 mL 100% ethanol в микроцентрифужные пробирки объемом 15 mL. Маркируйте пробирки, закройте их крышками и отставьте до завершения анализа груминга. Также подготовьте как минимум один холостой образец, содержащий только 1 mL ethanol без мухи, для использования в качестве отрицательного контроля.

Соберите каждую камеру для груминга, прикрутив верхнюю скользящую пластину с меньшими отверстиями, но оставив нижнюю пластину с более крупными отверстиями снятой для добавления пыли. Положите каждую необходимую камеру для груминга на стол верхней стороной вниз. Загрузите в каждую камеру аликвоту в пять миллиграммов ярко-желтого красителя, постукивая пробиркой по поверхности камеры над нужной лункой.

Постучите камерой по столу, чтобы вся пыль просеялась через сетку на верхнюю часть планшета. Затем прикрутите нижнюю пластину к каждой камере так, чтобы широкие концы конических отверстий были направлены наружу, а отверстия не находились над лунками. Плотно зафиксируйте нижнюю пластину, чтобы она не сдвигалась и не допустила утечки красителя.

Переверните камеру и несколько раз резко прижмите ее к столу, чтобы пыль прошла через сетку и осела на нижней пластине. Сдвиньте верхнюю пластину камеры в открытое положение так, чтобы маленькие отверстия совпали с 15 лунками, что позволит поместить мух в отдельные лунки. Заберите одну муху в аспиратор, аккуратно втянув воздух через один конец аспиратора, как при использовании соломинки.

Поместите мух, осторожно выдувая их и направляя отверстие в сторону цели. После заполнения лунки сдвиньте верхнюю пластину так, чтобы муха оказалась заблокированной в камере, и заклейте отверстие лунки скотчем во время заполнения камер с отверстиями, чтобы предотвратить побег мухи при заполнении других лунок. Если в одну лунку было втянуто несколько мух, оставьте это отверстие открытым до тех пор, пока не останется только одна муха.

После того как все необходимые лунки будут заполнены мухами, переверните камеру так, чтобы нижняя пластина оказалась сверху, и пыль могла покрыть мух, просеиваясь через сетку. Плотно зафиксируйте верхнюю и нижнюю пластины, затянув винты, и перемешайте содержимое камеры на вортексе в течение четырех секунд для обсыпки мух. Дважды ударьте камерой верхней пластиной вниз о стол, чтобы остатки красителя выпали с другой стороны.

Затем переверните камеру верхней пластиной вверх и дважды постучите по ней, чтобы краситель осел на дне нижней камеры, вдали от мух, удерживаемых в верхней камере. Для контрольных мух, которым не разрешено проводить груминг, немедленно переходите к подготовке проб. Положите камеру горизонтально на стол или столешницу верхней пластиной вверх на 30 минут, чтобы мухи могли провести груминг.

Поместите камеру в место, свободное от шума и вибраций, чтобы обеспечить постоянство условий окружающей среды для всех экспериментов по грумингу. Удерживая камеру в горизонтальном положении верхней пластиной вверх, осторожно открутите нижнюю пластину и снимите ее с камеры, стараясь не пролить краситель. Поместите камеру на подушку с CO2 при низком потоке воздуха до тех пор, пока мухи не будут анестезированы.

Отвинтите верхнюю крышку камеры, осторожно с помощью пинцета захватите муху за ножку, извлеките по одной окрашенной мухе из каждой камеры и поместите их в микроцентрифужные пробирки объемом 1.5 milliliter, содержащие этанол. Когда в каждой микроцентрифужной пробирке окажется по одной мухе, закройте крышку и трижды переверните пробирки, чтобы перемешать раствор красителя и этанола. Инкубируйте пробирки с этанолом и мухами в течение пяти часов при комнатной температуре, чтобы обеспечить полное вымывание красителя из организма мухи в раствор.

Через пять часов кратковременно перемешайте каждую пробирку на вортексе в течение двух секунд, чтобы обеспечить полное удаление красителей с мух. Перенесите 50 µL из экспериментальной пробирки объемом 1.5 mL в лунку планшета на 96 лунок, фиксируя расположение каждого образца на планшете. Добавьте 200 µL этанола, чтобы разбавить образец в пять раз; это необходимо для предотвращения эффектов экранирования у сильно запыленных мух или при наличии значительных дефектов груминга.

Используйте планшетный ридер для анализа каждого образца при 397 нанометрах. Зафиксируйте показатели образцов с помощью планшетного ридера и сохраните таблицу с результатами измерений образцов на планшете. Мы использовали этот метод для изучения DopR путем сравнения интенсивности груминга у сильного гипоморфа и нуль-мутантов по DopR со штаммом дикого типа.

Мутанты DopR удерживали значительно больше красителя, чем особи дикого типа или их восстановленные аналоги, что указывает на меньшую эффективность поведения по уходу за собой (груминга) у мутантов DopR. В параллельном эксперименте с мухами Rutabaga мутанты продемонстрировали более высокие уровни накопления красителя, чем мутанты DopR, что свидетельствует о значимой роли DopR в поведении по уходу за собой. После просмотра этого видео вы должны хорошо усвоить, как обращаться с мухами для проведения поведенческих тестов, а также как измерять интенсивность груминга.