Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки

Общая цель данного метода тандемной аффинной очистки заключается в выделении белковых комплексов, экспрессируемых в эукариотических клетках, для биохимической характеристики, изучения молекулярной сборки, а также идентификации новых интеракторов и посттрансляционных модификаций, которые регулируют их функцию. Этот метод позволяет очищать интактные белковые комплексы из эукариотических клеток для выявления новых интеракторов и регуляторных посттрансляционных модификаций, тонко настраивающих их работу. Основным преимуществом данной методики является обеспечение высокой чистоты и выхода белковых комплексов для последующего применения in vitro с целью изучения их функции и активности.

Клетки собирают после аффинной очистки с помощью STREP через 48 часов после трансфекции. Удалите среду и добавьте восемь миллилитров холодного PBS. Повторно аспирируйте и вытесните жидкость с помощью пипетки, чтобы отделить клетки от планшета.

Соберите и перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте клетки при 800 ×g в течение четырех минут при температуре четыре градуса Цельсия. Удалите супернатант PBS. Центрифугируйте при 800 ×g в течение одной минуты при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы удалить остатки PBS.

Для начала данной процедуры ресуспендируйте каждый осадок клеток в объеме буфера для пассивного лизиса (PLB), в пять раз превышающем объем осадка клеток. Перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Кратковременно перемешайте суспензию на вортексе, затем подвергните нутационному перемешиванию в течение 30 минут при температуре 4 °C.

Центрифугируйте суспензию клеток при 10 000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C. Перенесите растворимый лизат в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, а клеточный осадок удалите. Сохраните 10% от конечного объема растворимого лизата в качестве входного контроля (input) STREP-AP и храните его при температуре 4 °C.

Важно использовать STREP-биды для первого этапа аффинной очистки, так как комплексы, выделенные с помощью STREP-бидов, обеспечивают значительно больший выход белка, чем комплексы, выделенные с помощью FLAG-бидов. С помощью наконечника для пипетки с широким отверстием перенесите соответствующее количество 50% суспензии STREP-бидов для аффинной очистки. Центрифугируйте при 1,500 ×g в течение двух минут при температуре 4 °C.

Удалите супернатант и добавьте к гранулам 500 µL PLB. Перемешивайте смесь гранул на нутаторе в течение пяти минут при температуре 4 °C. Снова центрифугируйте для осаждения.

После третьей промывки удалите супернатант и ресуспендируйте гранулы в PLB до конечного объема, равного n × 40 мкл, где n — количество образцов. Добавьте 40 мкл суспензии STREP-гранул в каждый образец лизата клеток и инкубируйте на ротаторе в течение двух часов при температуре 4 °C. В процессе продукции и выделения белка можно использовать несколько планшетов с клетками, при этом образцы одного и того же белка, полученные путем лизиса клеток из разных планшетов, можно объединить и очистить одной порцией гранул методом STREP-аффинной очистки.

После инкубации смесей клеточного лизата и суспензии сорбента STREP в течение двух часов центрифугируйте их при 1 500 ×g в течение двух минут при температуре четыре градуса Цельсия. Сохраните супернатант как фракцию проскока STREP AP и храните при температуре четыре градуса Цельсия. Добавьте к гранулам 500 µL промывочного буфера STREP AP 1.

Перемешивайте бусины в смеси буферов на нутаторе в течение пяти минут при температуре 4 °C, затем центрифугируйте при 1 500 ×g в течение двух минут при 4 °C. Удалите супернатант и повторно промойте бусины 500 µL промывочного буфера STREP AP wash buffer one. После третьей промывки перенесите суспензию бусин в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, чтобы снизить фоновый уровень белка.

Промойте в четвертый раз буфером для промывки STREP AP один. После центрифугирования удалите супернатант и добавьте 500 µL буфера для промывки два. Доведите бусины до равновесного состояния, переворачивая пробирки, а затем центрифугируйте при 1 500 ×g в течение двух минут при 4 °C.

Слейте супернатант. Элюируйте целевой белок с помощью 50 µL буфера для элюции STREP. Перемешайте на вортексе при 800 об/мин в течение 15 минут при температуре 4 °C.

Центрифугируйте гранулы при 1 500 ×g в течение одной минуты при температуре 4 °C. Соберите супернатант. Эта фракция соответствует образцу элюции STREP AP.

Храните фракцию с бисерами при температуре four degrees Celsius для второго этапа элюции. Отберите аликвоту 10% элюата STREP AP для окрашивания серебром и/или вестерн-блоттинга. Для увеличения количества исходного материала перед последующим иммунопреципитацией по FLAG можно объединить первую и вторую элюции STREP для более эффективного извлечения элюата FLAG.

Начните выполнение данной процедуры, перенеся с помощью наконечника для пипетки с широким отверстием соответствующий объем раствора флаг-бусин (FLAG bead solution) в микроцентрифужную пробирку. Центрифугируйте при 1 500 ×g в течение двух минут при температуре четырех °C. Удалите супернатант и добавьте к бусинам 500 µL промывочного буфера FLAG.

Центрифугируйте при 1 500 ×g в течение двух минут при температуре четырех градусов Цельсия. Удалите супернатант и повторно промойте буфером для промывки FLAG. После третьей промывки удалите супернатант и ресуспендируйте гранулы в буфере для промывки FLAG до конечного объема n × 16 µL, где n — количество образцов.

Добавьте 16 µL суспензии бусин с FLAG к оставшемуся элюату STREP AP и перемешивайте на нутаторе в течение ночи при температуре 4 °C. После инкубации суспензии бусин с FLAG и элюата STREP AP в течение ночи перейдите к иммунопреципитации FLAG. Центрифугируйте суспензию бусин с FLAG при 1 500 ×g в течение двух минут при температуре 4 °C.

Сохраните супернатант в качестве фракции, прошедшей через FLAG IP, и храните при температуре 4 °C. Добавьте к гранулам 500 µL промывочного буфера FLAG. Перемешивайте на нутаторе в течение пяти минут при температуре 4 °C, затем центрифугируйте при 1 500 ×g в течение двух минут при температуре 4 °C.

Удалите супернатант и повторите промывку 500 µL буфера для промывки FLAG. После третьей промывки перенесите раствор с белком на гранулах в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для снижения фонового сигнала. Промойте в четвертый раз буфером для промывки FLAG.

Удалите супернатант после финального центрифугирования и добавьте к гранулам 30 µL промывочного буфера FLAG, содержащего 200 ng/µL FLAG-пептида. Перемешивайте на вортексе при 800 rpm в течение двух часов при температуре 4 °C. Через два часа центрифугируйте суспензию при 1 500 ×g в течение двух минут при температуре 4 °C.

Соберите супернатант и храните его при температуре четыре градуса Цельсия в качестве элюата FLAG IP. В данном видео метод тандемной аффинной очистки, или метод TAP, был применен к комплексу Cyclin-T1 CDK9. Cyclin-T1 с STREP-меткой и CDK9 с FLAG-меткой были гиперэкспрессированы в клетках HEK293 T.

Также был проведен взаимный эксперимент с использованием CDK9 с STREP-меткой и Cyclin-T1 с FLAG-меткой. Вестерн-блот-анализ показывает, что CDK9 с FLAG-меткой коэлюировал с Cyclin-T1 с STREP-меткой с STREP-бидс, но не в отрицательном контроле (AP без Cyclin-T1 с STREP-меткой). Оба белка были обнаружены в FLAG-элюате, что дополнительно подтвердило формирование комплекса.

Результаты реципрокного TAP-анализа показывают, что Cyclin-T1 с FLAG-меткой коэлюировался с CDK9 с STREP-меткой, что дополнительно подтверждает независимость взаимодействия Cyclin-T1 и CDK9 от используемых эпитопов. Результаты TAP и реципрокного TAP также были проанализированы с помощью окрашивания серебром. Звездочками отмечены коэлюировавшие примеси.

CDK9 с FLAG-меткой коэлюировался с Cyclin-T1 с STREP-меткой с STREP-гранул, но не с контрольной AP. При последующем элюировании по FLAG-метке Cyclin-T1 с STREP-меткой коэлюировался с CDK9 с FLAG-меткой с FLAG-гранул. Аналогично, Cyclin-T1 с FLAG-меткой коэлюировался с CDK9 с STREP-меткой с STREP-гранул, но не с контрольной AP. Белковый комплекс был эффективно выделен после второго этапа FLAG-иммунопреципитации. При должном исполнении данная методика может быть реализована за два дня, начиная с момента готовности клеток к сбору.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости соответствующего увеличения количества планшетов с клетками для каждого эксперимента, чтобы обеспечить выделение и детектирование достаточного количества белка. Это необходимо, например, для идентификации новых регуляторных субъединиц и/или изучения посттрансляционных модификаций субъединиц комплекса. После своей разработки этот метод открыл исследователям, изучающим белок-белковые взаимодействия, путь к поиску новых интеракторов и изучению посттрансляционных модификаций в эукариотических клетках.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделять и характеризовать белки с помощью STREP- и FLAG-меток.