Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки

Общая цель этого метода тандемной аффинной очистки заключается в выделении белковых комплексов, экспрессируемых эукариотическими клетками, для биохимической характеристики и молекулярных сборок, а также идентификации новых интеракторов и посттрансляционных модификаций, которые регулируют их функцию. Этот метод позволяет проводить очистку интактных белковых комплексов из эукариотических клеток для выявления новых интеракторов и регуляторных посттрансляционных модификаций, которые тонко настраивают их функцию. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет обеспечить высокую чистоту и выход белковых комплексов для последующего применения in vitro с целью изучения их функции и активности.

Клетки собираются путем аффинной очистки STREP через 48 часов после трансфекции. Удалите среду и добавьте восемь миллилитров холодной PBS. Проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы отделить ячейки от пластины.

Соберите и перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку и вращайте клетки при 800-кратном g в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость PBS. Вращайте при 800 g в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия, чтобы устранить остатки PBS.

Чтобы начать эту процедуру, ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в объеме, в пять раз превышающем объем клеточной гранулы буфера пассивного лизиса или PLB. Перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Кратковременно перебейте суспензию в вихрь, и взбейте в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия.

Уменьшите клеточную суспензию при 10 000 умноженных на g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перелейте растворимый лизат в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и выбросьте клеточную гранулу. Сохраните 10% от конечного объема растворимого лизата на входе STREP-AP и храните его при температуре четыре градуса Цельсия.

Важно использовать шарики STREP для первого этапа аффинной очистки, потому что комплексы, извлеченные с помощью шариков STREP, восстанавливают значительно больше белка, чем те, которые были поглощены с помощью шариков FLAG. С помощью наконечника пипетки с широким горлышком удалите необходимое количество 50% суспензии STREP для аффинной очистки. Вращайте при перегрузке в 1,500 раз g в течение двух минут при четырех градусах Цельсия.

Удалите надосадочную жидкость и добавьте в бусины 500 микролитров PLB. Взбейте смесь бусин в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия. Снова убавьте обороты.

После третьей промывки удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте шарики в PLB до конечного объема n умножить на 40 микролитров, где n — количество образцов. Добавьте 40 микролитров суспензии из гранул 50% STREP в каждый образец лизата клеток и измельчайте в течение двух часов при температуре четыре градуса Цельсия. Во время этого производства и восстановления белка можно использовать несколько пластин клеток, и одни и те же образцы белка, лизированные из разных пластин, могут быть объединены с одной порцией гранул во время аффинной очистки STREP.

клеточный лизат и суспензионные смеси STREP будут инкубированы в течение двух часов, уменьшите их при 1500 g в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Сохраните надосадочную жидкость при прохождении STREP AP и храните при температуре четыре градуса Цельсия. Добавьте 500 микролитров промывочного буфера STREP AP в один раз в бусины.

Измельчите шарики в буферной смеси в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и центрифугируйте при 1500 г в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и снова промойте 500 микролитрами буфера для стирки STREP AP. После третьей промывки переложите раствор в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, чтобы снизить белковый фон.

Промойте четвертый раз с помощью буфера для стирки STREP AP. После отжима снимите надосадочную жидкость и добавьте 500 микролитров смывочного масла два. Уравновесьте бусины, перевернув трубки, а затем вращайте вниз со скоростью 1,500 g в течение двух минут при четырех градусах Цельсия.

Выбросьте надосадочную жидкость. Разбавьте интересующий белок 50 микролитрами элюирующего буфера STREP. Вихрь при 800 об/мин в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Крутите бусины при 1,500 g в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость. Эта фракция соответствует элюирующему образцу STREP AP.

Сохраните фракцию бусин при четырех градусах Цельсия для повторного вымывания. Аликвота 10% элюирования STREP AP для окрашивания серебра и/или вестерн-блоттинга. Для увеличения количества исходного материала для последующей иммунопреципитации FLAG первый и второй элюции STREP могут быть объединены для более эффективного восстановления элюирования FLAG.

Начните эту процедуру с помощью наконечника пипетки с широким горлышком, чтобы перенести соответствующее количество раствора FLAG в микроцентрифужную пробирку. Вращайте при перегрузке в 1,500 раз g в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Снимите надосадочную жидкость и добавьте в бусины 500 микролитров буфера для стирки FLAG.

Вращайте при перегрузке в 1,500 раз g в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и снова промойте с помощью буфера для стирки FLAG. После третьей промывки удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте шарики в буфере для промывки FLAG до конечного объема n умножить на 16 микролитров, где n — количество образцов.

Добавьте 16 микролитров суспензии для гранул FLAG к оставшемуся элюированию STREP AP и напейте на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. После ночной инкубации суспензии гранул FLAG и элюирования STREP AP продолжайте иммунопреципитацию FLAG. Уменьшите суспензию борта FLAG при перегрузке в 1 500 раз g в течение двух минут при четырех градусах Цельсия.

Сохраните надосадочную жидкость при прохождении FLAG IP и храните при температуре четыре градуса Цельсия. Добавьте в бусины 500 микролитров буфера для стирки FLAG. Наденьте в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и центрифугируйте при 1500 умноженных на g в течение двух минут при четырех градусах Цельсия.

Выбросьте надосадочную жидкость и снова промойте 500 микролитрами буфера для стирки FLAG. После третьей промывки перелейте раствор белковых шариков в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, чтобы уменьшить фон. Промойте в четвертый раз с помощью буфера для стирки FLAG.

Снимите надосадочную жидкость с конечного отжима и добавьте в шарики 30 микролитров промывочного буфера FLAG, содержащего 200 нанограмм на микролитр пептида FLAG. Вихрь при 800 об/мин в течение двух часов при четырех градусах Цельсия. Через два часа уменьшите вес при перегрузке в 1 500 раз g в течение двух минут при четырех градусах Цельсия.

Соберите надосадочную жидкость и храните при температуре четыре градуса Цельсия в качестве элюирования FLAG IP. В этом видео к комплексу Cyclin-T1 CDK9 была применена аффинная очистка Tandem, или метод TAP. STREP меченный Cyclin-T1 и меченный FLAG CKD9 были сверхэкспрессированы в HEK293 T клетках.

Также был проведен реципрокный эксперимент с тегом STREP CDK9 и FLAG с тегом Cyclin-T1. Вестерн-блоттинг показывает, что FLAG, помеченный CKD9, коэлюированный с STREP, помечал Cyclin-T1 из гранул STREP, но не в отрицательном контроле, AP без STREP мечен Cyclin-T1. Оба белка были обнаружены в элюции FLAG, что еще раз подтвердило образование комплекса.

Взаимные результаты TAP показывают, что FLAG, помеченный Cyclin-T1, коэлюирован с STREP, мечен CDK9, что еще раз подтверждает, что взаимодействие Cyclin-T1 CDK9 не зависит от используемых эпитопов. Результаты ТАП и реципрокного ТАП также были проанализированы путем окрашивания серебром. Звездочками обозначены коэлюированные примеси.

FLAG помечен CKD9 с помощью STREP помечен Cyclin-T1 с бусин STREP, но не с контрольной AP.In последующего элюирования FLAG, STREP помечен Cyclin-T1 с помощью FLAG помечен CDK9 с бусин FLAG. Аналогично, FLAG помечал Cyclin-T1, коэлюированный с помощью STREP, помечал CDK9 на бусинах STREP, но не на контрольной AP. И белок-белковый комплекс был эффективно восстановлен после второго этапа FLAG IP. После освоения этой техники ее можно выполнить за два дня, начиная с того момента, когда клетки будут готовы к сбору, если она будет выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить об увеличении количества клеточных пластин в эксперименте соответственно, чтобы обеспечить достаточное количество белка, которое может быть восстановлено и обнаружено. Например, идентификация новых регуляторных субъединиц и/или изучение посттрансляционных модификаций сложных субъединиц. После своего развития этот метод проложил путь исследователям, изучающим белок-белковые взаимодействия, к изучению новых интеракторов и посттрансляционных модификаций в эукариотических клетках.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выделять и характеризовать белки с помощью меток STREP и FLAG.