Условный Перепрограммирование педиатрический человеческого пищеводного эпителиальных клеток для использования в тканевой инженерии и профилактике заболеваний Исследование

Общая цель данной процедуры заключается в экспансии эпителиальных клеток пищевода, полученных из эндоскопических биопсий пациентов, для изучения заболеваний пищевода или создания трехмерного (3D) каркаса пищевода для последующего моделирования или замены тканей пищевода. Этот метод может быть использован для более глубокого понимания роли эпителиальных клеток пищевода в развитии заболеваний пищевода. Также они могут быть использованы для создания 3D-каркасов для моделирования или имплантации.

Преимущество данного метода заключается в том, что он позволяет получать специфические эпителиальные клетки пациента из очень маленького фрагмента ткани без необходимости каких-либо генетических или перманентных модификаций. Значимость этого метода распространяется на изучение патогенеза эозинофильного эзофагита, а также на разработку методов лечения эзофагеальной атрезии и эозинофильного эзофагита. Как правило, лица, только начинающие осваивать этот метод, сталкиваются с трудностями при полном удалении фидерных клеток перед сбором эпителиальных клеток пищевода человека для обеспечения чистоты культуры.

Эту технику продемонстрирует Кристофер Фостер, техник нашей лаборатории. Минимум за три дня до получения образцов пациента высейте клетки 3T3 в культуральную среду для 3T3 в T75-фласки с обработанной поверхностью. В день эксперимента, непосредственно перед получением образцов, отделите клетки 3T3, добавив в каждую колбу по 5 milliliters 0,25% Trypsin-EDTA примерно на пять минут при 37 °C.

Когда большинство клеток окажутся во взвешенном состоянии, добавьте 5 мл среды 3T3, чтобы остановить реакцию, и перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл для центрифугирования. Ресуспендируйте осадок в среде для подсчета клеток. Затем перенесите необходимое для посева количество клеток в коническую пробирку объемом 15 мл.

Затем добавьте 25 миллилитров свежей среды 3T3 к клеткам для облучения дозой 3000 рад. После этого соберите клетки путем центрифугирования и ресуспендируйте осадок в кондиционированной программирующей среде из расчета пять миллилитров на одну 100-миллиметровую чашку. После получения примерно шести биоптатов пищевода во время эндоскопии поместите шесть биоптатов в 15-миллилитровый конический центрифужный тюбик, содержащий полную бессывороточную среду для кератиноцитов с добавлением Primocin, на мокрый лед.

Поместите один биоптат в 5 мл буферизированного формалина на влажный лед, а другой биоптат — в небольшой криоформочка для биопсии, содержащую среду для заливки. Немедленно погрузите форму в стакан со льдом или пентаном, помещенный в контейнер с жидким азотом. После замораживания ткани поместите криоформочку в пакет для образцов на сухой лед в контейнер из пенополистирола.

Затем поместите пробирки с биоптатами в герметичный пакет, который следует положить в транспортный контейнер с маркировкой «биологическая опасность» и влажным льдом; плотно закройте и пометьте оба контейнера наклейкой «биологическая опасность» для транспортировки в лабораторию. По прибытии в лабораторию немедленно перенесите замороженный биоптат в хранилище при температуре -80 °C для последующего серийного срезания или экстракции RNA. Поместите образец в формалин в холодильнике при температуре 4 °C для фиксации в течение ночи, а остальные биоптаты поместите в центрифугу.

Замените среду в каждой пробирке на 10 milliliters раствора диспазы, закройте пробирки и инкубируйте в течение 15 минут при 37 degree Celsius на водяной бане. По окончании инкубации снова центрифугируйте биоптаты, после чего ресуспендируйте образцы в пяти milliliters 0,25%Trypsin-EDTA. Перенесите биоптаты в одну стерильную чашку объемом 100 milliliters и с помощью двух стерилизованных лезвий измельчите ткани максимально мелко.

После того как все ткани будут измельчены, перенесите фрагменты ткани в новую пробирку объемом 15 миллилитров и дважды промойте планшет пятью миллилитрами 0,05% Trypsin-EDTA. Соберите промывочные растворы в пробирке и верните образцы в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. Через 10 минут центрифугируйте переваренные фрагменты образцов и фидерные клетки, затем ресуспендируйте полученные осадки в пяти миллилитрах среды для условного перепрограммирования для каждого образца.

Затем объедините образцы фидерных клеток и биопсии пищевода в одной пробирке и добавьте к клеткам ингибитор Rho-киназы (ROCK) для их совместного культивирования в чашке для культивирования тканей, покрытой желатином. Примерно через пять дней удалите среду и измельченные фрагменты биопсии с помощью аспиратора и промойте чашку два-три раза пятью миллилитрами стерильного PBS. После последнего промывания добавьте в чашку 10 миллилитров свежей среды с добавлением ингибитора ROCK и верните совместную культуру в инкубатор до достижения клетками 70% конфлюэнтности.

Для экспансии клеток удалите фидерные клетки, добавив пять миллилитров 0,05% Trypsin-EDTA при 37 °C не более чем на две с половиной минуты. Промойте планшет пятью миллилитрами свежего PBS, чтобы удалить плавающие фидерные клетки, и добавьте пять миллилитров 0,25% Trypsin-EDTA для инкубации в течение 5–10 минут, пока клетки биопсийного образца не открепятся от дна планшета. Затем остановите реакцию, добавив 10 миллилитров свежей среды, и перенесите клетки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров для центрифугирования.

Перевзвесьте осадок в свежей среде для условного перепрограммирования для подсчета, после чего перенесите 1 × 10⁶ клеток пищевода человека в новый конический тубус. Добавьте к клеткам пищевода 1,2 × 10⁶ облученных клеток 3T3 и доведите общий объем в тубусе до 15 мл свежей средой для условного перепрограммирования. Затем добавьте к клеткам свежий ингибитор ROCK и высейте кокультуру в 150-миллиметровую чашку, покрытую желатином.

Для замораживания клеток пищевода для хранения при температуре -80 °C удалите фидерные клетки и отделите клетки пищевода, как было показано ранее. Затем перенесите клетки в новую коническую пробирку объемом 50 мл для центрифугирования и ресуспендируйте осадок в среде для замораживания до концентрации 1 × 10⁶ клеток на 2 мл. После этого перенесите по 2 мл клеточной суспензии в каждую предварительно промаркированную криопробирку и храните образцы при температуре -80 °C не менее 24 часов перед перемещением в долгосрочное хранилище в жидком азоте.

Колонии эпителиальных клеток сформируются примерно через четыре-пять дней и будут окружены фидерными клетками-фибробластами. По мере роста эти колонии будут сливаться с другими, образуя более крупные скопления. Когда культура достигнет 70% конфлюэнтности, потребуется ее пересев для дальнейшего расширения.

После удаления фидерных клеток адгезивные эпителиальные клетки можно трипсинизировать и повторно высеять на новые облученные фидерные клетки. Фенотипическая характеристика этих клеток с помощью qRT-PCR выявляет повышение экспрессии P63, маркера клеток-предшественников, в конце первого пассажа по сравнению с исходным образцом биопсии, что указывает на перепрограммирование клеток в более стволоподобное состояние предшественников. При переносе этих клеток на обычные планшеты для культивирования тканей экспрессия P63 снижается, а экспрессия белка плотных контактов 1 (TJP1) и E-кадгерина увеличивается, что демонстрирует смену фенотипа от клетки-предшественника к более дифференцированной эпителиальной клетке.

Проточный цитометрический анализ клеток после первого пассажа показывает, что более 90% клеток также положительны по EpCAM. Иммунофлуоресцентное окрашивание демонстрирует, что клетки сохраняют экспрессию эпителиального маркера, маркера клеток-предшественников, маркера пролиферации и белка плотных соединений эпителия. Время удвоения клеток пищевода пациента без патологий составляет примерно от 36 до 40 часов, хотя, вероятно, время удвоения патологически измененных клеток будет больше.

После освоения данной методики выполнение процедуры должно занимать примерно один час. При проведении данной процедуры обязательно соблюдайте правила асептики для предотвращения контаминации и работайте максимально оперативно для сохранения жизнеспособности клеток. После завершения данной процедуры можно провести другие анализы, такие как культивирование в трансвелл-системах, чтобы определить, какие антигены вызывают воспаление или патогенез пищевода.

После разработки данный анализ позволит исследователям идентифицировать триггерные антигены, вызывающие эозинофильный эзофагит, а также найти новые варианты лечения таких пациентов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать и экспандировать эпителиальные клетки пищевода из эндоскопических биоптатов для использования при изучении заболеваний пищевода или создании 3D-моделей. Не забывайте, что работа с острыми инструментами и биологическими тканями может быть опасной.

Обязательно утилизируйте острые инструменты надлежащим образом и соблюдайте правила биобезопасности.