Условный Перепрограммирование педиатрический человеческого пищеводного эпителиальных клеток для использования в тканевой инженерии и профилактике заболеваний Исследование

Общая цель этой процедуры заключается в расширении эпителиальных клеток пищевода, полученных от пациента из эндоскопических биопсий, для изучения заболеваний пищевода или в создании 3D-каркаса пищевода для последующего моделирования или замены тканей пищевода. Этот метод может быть использован для лучшего понимания роли эпителиальных клеток пищевода при заболевании пищевода. С их помощью также можно увидеть 3D-скаффолды для моделирования или имплантации.

Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет нам создавать специфические эпителиальные клетки пациента из очень маленького кусочка ткани без необходимости каких-либо генетических или постоянных модификаций. Применение этого метода распространяется на понимание патогенеза эозинофильного эзофагита, а также на разработку методов лечения атрезии пищевода и эозинофильного эзофагита. Как правило, люди, плохо знакомые с этой техникой, будут испытывать трудности с возможностью полного удаления питающих клеток перед забором эпителиальных клеток пищевода человека, чтобы сохранить чистоту.

Демонстрировать эту технику будет Кристофер Фостер, техник из нашей лаборатории. Не менее чем за три дня до получения образцов пациента поместите клетки 3Т3 в культуральную среду 3Т3 в обработанные тканью колбы Т75. В день эксперимента, непосредственно перед получением образцов, отделите клетки 3T3 с 5 миллилитрами 0,25% трипсина-ЭДТА в колбе примерно на пять минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Когда большая часть клеток всплывет, добавьте 5 миллилитров среды 3T3, чтобы остановить реакцию, и переложите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров для центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в среде для подсчета. Затем переложите соответствующее количество ячеек для посева в коническую трубку объемом 15 миллилитров.

Далее добавьте в клетки 25 миллилитров свежей среды 3Т3 для облучения при 3000 рад. Затем соберите ячейки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в среде условного программирования из расчета пять миллилитров на 100-миллиметровую пластину. После получения примерно шести биопсий пищевода во время эндоскопии поместите шесть биопсий в 15-миллилитровую коническую пробирку, содержащую полную бессывороточную кератиноцитарную среду, дополненную примоцином, на влажном льду.

Поместите одну биопсию на пять миллилитров буферного формалина на мокрый лед и поместите одну биопсию в небольшой биопсийный криомолд, содержащий встраиваемую среду. Сразу же погрузите форму в стакан со льдом или пентаном внутрь емкости с жидким азотом. После того, как ткань будет заморожена, поместите криомолд в мешок для образцов на сухом льду, в контейнер из пенополистирола.

Затем поместите пробирки с биопсией в герметичный пакет внутри транспортной коробки с этикеткой биологической опасности, содержащей мокрый лед, и запечатайте и промаркируйте оба контейнера наклейкой с биологической опасностью для транспортировки в лабораторию. При поступлении в лабораторию немедленно перенесите замороженную биопсию в хранилище при температуре минус 80 градусов Цельсия для последующего среза или экстракции РНК. Поместите образец в формалин в холодильник с температурой четыре градуса Цельсия для фиксации на ночь, а оставшиеся биопсии поместите в центрифугу.

Замените среду в каждой пробирке на 10 миллилитров раствора и закупорьте пробирки на 15-минутную инкубацию при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане. В конце инкубации снова поверните биопсию вниз и повторно суспендируйте образцы в пяти миллилитрах 0,25% трипсина-ЭДТА. Перенесите биопсию в одну стерильную пластину объемом 100 миллилитров и используйте две стерилизованные бритвы, чтобы измельчить ткани как можно мельче.

Когда вся ткань будет разрезана, перенесите фрагменты ткани в новую 15-миллилитровую трубку и промойте пластину два раза пятью миллилитрами 0,05% трипсина-ЭДТА. Соберите смыватели в пробирке и верните образцы на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. Через 10 минут центрифугируйте переваренные образцы и питательные ячейки, а также повторно суспендируйте гранулы в пяти миллилитрах условно перепрограммированной среды каждая.

Затем объедините образцы биопсии пищевода и пищевода в одну пробирку и добавьте рокиназу или ингибитор ROCK к клеткам для их совместного культивирования на чашке для культуры тканей, покрытой желатином. Примерно через пять дней удалите среду и измельченные кусочки биопсии с помощью аспирации и ополосните чашку два-три раза пятью миллилитрами стерильного PBS. После последней промывки добавьте в тарелку 10 миллилитров свежей среды, обогащенной ингибитором ROCK, и верните сокультуру в инкубатор до тех пор, пока клетки не достигнут 70% конфлюенции.

Чтобы расширить клетки, уберите из кормушек пять миллилитров 0,05%-ного трипсина-ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия не более чем на две с половиной минуты. Промойте планшет пятью миллилитрами свежего PBS, чтобы удалить плавающие питающие клетки, и добавьте пять миллилитров 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 5-10 минут инкубации до тех пор, пока клетки биопсийного образца не будут отделены от нижней части планшета. Затем остановите реакцию с помощью 10 миллилитров свежей среды, и переложите клетки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров для центрифугирования.

Повторно суспендируйте гранулу в свежей условной перепрограммирующей среде для подсчета, и теперь учитывайте один умноженный на 10 до шестой клетки пищевода человека в новую коническую трубку. Добавьте в 1,2 раза по 10 на шестую облученные клетки 3Т3 к клеткам пищевода, и доведите общий объем в пробирке до 15 миллилитров свежей средой условного перепрограммирования. Затем добавьте в клетки свежий ингибитор ROCK и выложите сокультуру на 150-миллиметровую чашку, покрытую желатином.

Чтобы заморозить клетки пищевода для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию, удалите питатели и отделите клетки пищевода, как показано выше. Далее переложите клетки в новую коническую пробирку объемом 50 миллилитров для центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в соотношении один умножить на 10 к шестой клетке на два миллилитра концентрации замораживающей среды. Затем перенесите два миллилитра клеток в каждый предварительно помеченный криовиал и храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия не менее 24 часов, прежде чем переместить их в долгосрочное хранилище жидкого азота.

Колонии эпителиальных клеток сформируются примерно за четыре-пять дней и будут окружены фидерными клетками фибробластов. По мере того, как эти колонии расширяются, они будут сливаться с другими колониями, образуя более крупные колонии. Как только культура стала на 70% сливающейся, их необходимо расширить.

После того, как фидерные клетки были удалены, адгезивные эпителиальные клетки могут быть трипсонизированы и повторно помещены на новые облученные фидерные клетки. Фенотипическая характеристика этих клеток с помощью qRT-PCR показывает повышение регуляции P63, маркера клеток-предшественников в конце первого пассажа, по сравнению с исходным образцом biospy, что указывает на то, что клетки были перепрограммированы в более прогениторное стволовое состояние. Когда эти клетки переносятся в нормальные тканевые культуральные планшеты, экспрессия P63 снижается, а экспрессия белка плотного соединения, или TJP1, и E-кадгерина увеличивается, демонстрируя сдвиг фенотипа от клетки-предшественника к более дифференцированной эпителиальной клетке.

Проточный цитометрический анализ клеток после первого пассажа показывает, что более 90% клеток также положительны на EpCAM. Иммунофлуоресцентное окрашивание демонстрирует, что клетки сохраняют свой эпителиальный маркер, маркер предшественника, маркер пролиферации и экспрессию белка эпителиального плотного соединения. Время удвоения клеток пищевода у небольного пациента составляет примерно от 36 до 40 часов, хотя вполне вероятно, что время удвоения больных клеток будет медленнее.

После освоения этой техники она должна быть завершена примерно за один час. Пытаясь выполнить эту процедуру, обязательно используйте стерильную технику для предотвращения загрязнения и обязательно работайте оперативно, чтобы сохранить жизнеспособность клеток. После этой процедуры могут быть проведены другие анализы, такие как трансвелл-культура, чтобы оценить, какие антигены вызывают воспаление пищевода или патогенез.

После разработки этот анализ проложит путь исследователям к выявлению триггерных антигенов, вызывающих эозинофильный эзофагит, а также к новым вариантам лечения этих пациентов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять и расширять эпителиальные клетки пищевода из эндоскопических биопсий для использования при изучении заболеваний пищевода или создании 3D-моделей. Не забывайте, что работа с острыми инструментами и биологическими тканями может быть опасной.

Обязательно утилизируйте острые инструменты правильно и используйте передовые методы биобезопасности.