MitoCeption: Передача Изолированные Человеческий MSC митохондрии глиобластомы стволовых клеток

Общая цель этой процедуры заключается в переносе ранее выделенных митохондрий из донорских клеток, таких как мезенхимальные стволовые клетки, в клетки-мишени, такие как стволовые клетки глиобластомы. Эта процедура может помочь ответить на ключевые вопросы в области метаболизма, такие как метаболические и биологические эффекты митохондрий, которые спонтанно передаются между клетками с помощью таких процессов, как туннелирование нанотрубок или микровезикул. Основное преимущество этого метода заключается в том, что эффекты митохондрий могут быть оценены независимо от других факторов, присутствующих в микроокружении, таких как цитокины или метаболиты, а также других соединений, которые также могут быть перемещены в туннельных нанотрубках.

Для целей визуализации митохондрии МСК и ГСК могут быть помечены жизненно важными красителями до переноса митохондрий с помощью MitoCeption. Для начала, после предварительного мечения GSC жизненно важными красителями в соответствии с текстовым протоколом, соберите нейросферы GSC в 50-миллилитровую пробирку путем центрифугирования при 270 умноженных на g при 20 градусах Цельсия в течение пяти минут. Используйте пять миллилитров HBSS для промывания клеток и снова закрутите трубку.

Аспирируйте надосадочную жидкость и с помощью 100 микролитров 0,25% трипсина-ЭДТА аккуратно повторно суспендируйте гранулу GSC. Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут. Далее добавьте в пробирку 10 микролитров 20 миллимолярного хлорида кальция в двух микролитрах из расчета 10 миллиграмм на миллилитр ДНКазы I.

Диссоциируйте нейросферы с помощью пипетки P200, чтобы аккуратно пипетировать вверх и вниз от 30 до 50 раз, избегая образования пузырьков. Добавьте 10 микролитров 5%-ного ингибитора трипсина в 10 миллилитрах HBSS в клетки и центрифугируйте GSC в течение семи минут. Затем выбросьте надосадочную жидкость и 10 миллилитров GSC Basal Medium к образцу.

Теперь, используя счетную камеру Томы, подсчитайте ячейки, прежде чем снова вращаться. Добавьте соответствующий объем пролиферирующей среды GSC, чтобы получить клеточный концентрат от 10 до шестой GSC на миллилитр. Затем засейте от 10 до пятой части GSC в лунку 96-луночной пластины.

Центрифугируйте пластину так, чтобы ГСК оседали на дне лунок. Проверьте клетки под микроскопом. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия.

Чтобы провести выделение митохондрий МСК, начните с регулировки температуры микроцентрифуги до четырех градусов Цельсия. Подготовьте две 1,5-миллилитровые пробирки с маркировкой А и С, содержащие реагенты, для экстракции митохондрий. Подготовьте две дополнительные пробирки с маркировкой MSC и MiTo.

Держите трубки на льду. Также подготовьте трубки для серийных разведений митохондрий, которые будут созданы с помощью митохондриального препарата. Используйте 10 миллилитров PBS, предварительно подогретых до 37 градусов Цельсия, чтобы промыть MSC.

Затем двумя миллилитрами трипсина, не содержащего ЭДТА, промойте клетки в течение 10 секунд и добавьте еще один миллилитр трипсина, прежде чем инкубировать клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 5-10 минут. Следует избегать использования ЭДТА в соответствии с протоколом, в частности, для трипсинизации МСК и ингибитора протеазы, используемого в препарате митохондрий. Восстановите МСК, добавив 10 миллилитров Alpha MEM 10% FBS и перенесите суспензию в 50-миллилитровую трубку.

Затем центрифугируйте клетки. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 10 миллилитров Alpha MEM 10% FBS в клеточную гранулу. Затем используйте счетную камеру Малассеса для подсчета МСК, прежде чем вращаться вниз в четыре-пять раз по 10 до пятой ячейки.

Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте один миллилитр ледяного Alpha MEM 10% FBS в клеточную гранулу и перенесите клетки в заранее подготовленную пробирку, меченную MSC, продолжая держать ее на льду. Затем центрифугируйте пробирку MSC при 900-кратном g при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут и удалите всю остаточную среду из пробирки. Далее добавьте 200 микролитров реагента для выделения митохондрий А с ингибиторами протеазы без ЭДТА в МСК и делайте вихрь на средней скорости в течение пяти секунд.

Затем оставьте трубки на льду ровно на две минуты. Добавьте 2,5 микролитра реагента для выделения митохондрий B и делайте вихревыми движениями клетки на максимальной скорости в течение 10 секунд, прежде чем поместить трубки обратно на лед. Повторяйте вихрь каждые 30 секунд в течение пяти минут.

Теперь добавьте в пробирку 200 микролитров реагента для выделения митохондрий C с ингибиторами протеазы, не содержащими ЭДТА, и перемешайте содержимое, наклонив пробирку примерно в 30 раз. Центрифугируйте пробирки при 700 умноженных на g при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую митохондрии МСК, в заранее подготовленную трубку MiTo.

Центрифугируйте образец при 3000 умноженных на g при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. После удаления надосадочной жидкости используйте 200 микролитров реагента С для промывания митохондриальной гранулы. Затем вращайте суспензию при температуре 12 000 раз больше g при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы гранулировать органеллы.

Чтобы перенести изолированные митохондрии МСК в ГСК, добавьте 200 микролитров предварительно охлажденной пролиферирующей среды ГСК в митохондриальную гранулу. Разбавьте митохондриальный препарат в пролиферирующей среде GSC, чтобы обеспечить стабильное добавление 20 микролитров митохондриальной суспензии к GSC. Затем медленно добавьте митохондрии близко ко дну лунки.

Чтобы контролировать утечку жизненно важного красителя из митохондрий МСК, добавьте такое же количество препарата митохондрий в лунки 96-луночного планшета, содержащего только пролиферационную среду GSC. Центрифугируйте планшеты при 1,500 умноженных на g при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Затем сразу же поместите культуры при температуре 37 градусов по Цельсию.

На следующий день для анализа контрольных лунок на утечку жизненно важного красителя засейте клетки GSC, как описано ранее, центрифугируйте планшет, а затем инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Центрифугируйте на 96 лунках планшет, содержащий только митохондрии. Затем аспирируйте среду из луночного планшета GSC 96 и замените ее надосадочной жидкостью митохондрий.

Инкубируйте ГСК с надосадочной жидкостью митохондрий при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Наконец, проведите анализ переноса митохондрий, анализ FACS и конфокальную визуализацию в соответствии с текстовым протоколом. ГСК представляют собой раковые стволовые клетки, выращенные в виде нейросфер для сохранения свойств стволовых клеток.

Непосредственно перед митохондриальным переносом они засеваются в виде отдельных клеток, чтобы обеспечить высокую эффективность митохондриального переноса, и на следующий день, как показано здесь, наблюдается, как клетки снова формируют нейросферы. На этом рисунке можно увидеть, как флуоресцентно меченные митохондрии МСК локализованы внутри Gb4 GSC. Митохондрии МСК проявляются во всех ГСК, подобно митохондриям ГСК.

Перенос митохондрий МСК можно наблюдать для большинства ГСК в 3D-реконструкции по конфокальным изображениям ГСК, подтверждающих межклеточную локализацию перенесенных митохондрий МСК. Предварительная маркировка ГСК как синими клеточными красителями, так и красными митохондриальными жизненно важными красителями позволила визуализировать локализацию перенесенных митохондрий МСК, видимых зеленым цветом, относительно эндогенных митохондрий ГСК. Как показано на рисунке, MitoCeption с увеличением количества флуоресцентных митохондрий MSC приводил к усилению сигналов FACS и на несколько порядков превышал контрольный сигнал.

Представленный здесь протокол переноса митохондрий, выполненный на одноклеточных ГСК, показал дозозависимый ответ и относительную среднюю интенсивность флуоресценции. Наконец, хотя перенос митохондрий МСК также был достигнут на нейросферах ГСК, эффективность переноса на ГСК в этих условиях была ниже по сравнению с митохондриальным переносом на ГСК, впервые посеянные в виде одиночных клеток. После освоения этой техники ее можно выполнить за три часа, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что митохондрии всегда должны держать препарат на льду. После этих процедур могут быть выполнены другие методы, такие как FACS, конфокальная микроскопия, ПЦР на митохондриальной ДНК, чтобы визуализировать и количественно оценить перенос митохондрий МСК к клеткам-мишеням. Функциональные исследования также могут быть проведены для определения биологических эффектов перенесенных митохондрий.

Имейте в виду, что эти исследования, как правило, проводятся с меньшим количеством митохондрий, чем те, которые используются для визуализации переноса митохондрий. Этот метод позволит изучить исход и биологические эффекты митохондрий, которые спонтанно переносятся между клетками в нормальных физиологических или патологических условиях, и, таким образом, будет способствовать разработке новых терапевтических методов лечения.