Выделение неповрежденном Митохондрии из скелетных мышц с помощью дифференциального центрифугирования для измерения респирометрии высокого разрешения

Общая цель данной процедуры заключается в выделении митохондрий скелетных мышц методом дифференциального центрифугирования и определении скорости дыхания комплексов I, II и IV митохондриальной дыхательной цепи. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области митохондриальной биоэнергетики, касающиеся заболеваний и синдромов, связанных с митохондриальной дисфункцией, таких как различные неврологические заболевания, сепсис и возрастные расстройства. Основным преимуществом данной методики является отсутствие большинства цитологических факторов в препарате выделенных митохондрий, которые могут препятствовать анализу функций митохондрий. Процедуру продемонстрирует Сандра Нанзоз, техник моей лаборатории.

Для начала данной процедуры подготовьте стакан с образцами скелетных мышц, как описано в текстовом протоколе. Поместите стакан в ведро со льдом. С помощью тонких ножниц измельчите мышцы на кусочки размером от 1 до 2 мм.

Затем дважды промойте измельченную ткань ледяным буфером для изоляции, используя по 20 миллилитров для каждой промывки. Суспендируйте промытую ткань в 10 миллилитрах буфера для изоляции на грамм ткани, после чего добавьте пять миллиграммов протеазы G. Затем поместите стакан в ледяную баню с магнитной мешалкой и перемешивайте в течение 10 минут.

После этого разбавьте суспензию дополнительными 10 миллилитрами буфера для выделения с добавлением 0,2% обезжиренного BSA на грамм ткани. Затем слейте весь буфер для выделения из стакана. Дважды промойте ткань ледяным буфером для выделения с добавлением 0,2% BSA, используя по 20 миллилитров для каждой промывки.

Затем снова суспендируйте ткань в 10 миллилитрах изоляционного буфера с добавлением BSA на грамм ткани. Для гомогенизации ткани используйте полуавтоматический стеклянный гомогенизатор с пестиком со свободным ходом. Затем перенесите гомогенат в центрифужную пробирку и центрифугируйте при 10 000 ×g в течение 10 минут при температуре четырех градусов Цельсия.

С помощью серологической пипетки удалите супернатант. Ресуспендируйте осадок в среде для изоляции с добавлением BSA, охлажденной на льду, из расчета 10 миллилитров на грамм ткани. Центрифугируйте суспензию при 350 ×g в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия.

После этого с помощью серологической пипетки соберите супернатант, удалив осадок. Профильтруйте супернатант в стакан, помещенный на льду, через два слоя марли. Перенесите отфильтрованную суспензию в центрифужную пробирку и центрифугируйте при 7 000 ×g в течение 10 минут при температуре четырех градусов Цельсия.

Затем удалите супернатант. Ресуспендируйте осадок неочищенных митохондрий в пяти миллилитрах изоляционного буфера с добавлением BSA на грамм ткани. Центрифугируйте данную суспензию при 7 000 ×g в течение 10 минут при температуре four degrees Celsius.

Затем удалите супернатант и повторно суспендируйте осадок в 20 миллилитрах промывочного буфера. Центрифугируйте при 7 000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C. Повторите процесс ресуспендирования и центрифугирования еще один раз.

После этого удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в одном миллилитре промывочного буфера. Определите концентрацию белка любым стандартным методом. Затем храните концентрированную суспензию митохондрий на льду до начала проведения респирометрического анализа.

Для начала ресуспендируйте митохондриальный концентрат в дыхательном буфере до конечной концентрации 0,4 mg/mL митохондриального белка. Затем аспирируйте дыхательную среду из камеры оксиграфа, откалиброванной по воздуху. Добавьте 2,1 mL суспензии изолированных митохондрий.

Вставьте пробку, чтобы закрыть камеру оксиграфа. Затем непрерывно перемешивайте суспензию митохондрий при 700 RPM и 37 °C. Регистрируйте клеточное дыхание в базовом состоянии от трех до пяти минут до достижения стабильного сигнала потока кислорода.

Для инициации дыхания, зависящего от комплекса I, введите 12,5 µL 0,8 M малата в камеру оксиграфа с суспензией изолированных митохондрий через титановый порт для инъекций в пробке. Затем введите 10 µL 2 M глутамата. Регистрируйте клеточное дыхание в течение трех-пяти минут до достижения стабильного сигнала потока кислорода.

После этого через инъекционный порт введите в камеру 10 µL 0,05 M ADP. Регистрируйте клеточное дыхание до тех пор, пока сигнал потока кислорода не увеличится, затем не снизится и не стабилизируется. Для определения дыхания, зависимого от комплекса II, введите 2 µL 0,2 mM ротенона в камеру оксиграфа, подготовленную с суспензией изолированных митохондрий.

Регистрируйте клеточное дыхание до достижения стабильного сигнала потока кислорода. Затем введите 20 µL 1 M сукцината. Снова регистрируйте клеточное дыхание до достижения стабильного сигнала потока кислорода.

После этого введите 10 µL 0,05 M ADP в камеру через инжекционный порт. Регистрируйте клеточное дыхание до тех пор, пока сигнал потока кислорода не увеличится, затем не снизится и не стабилизируется. Для дыхания, зависящего от комплекса IV, введите 2,5 µL 0,8 mM аскорбата в камеру оксиграфа, подготовленную с суспензией изолированных митохондрий.

Затем немедленно введите 2,5 µL 0,2 M TMPD и 10 µL 0,05 M ADP. Регистрируйте клеточное дыхание до достижения стабильного сигнала потока кислорода. После этого введите 10 µL 1 M азида натрия.

Регистрируйте клеточное дыхание до тех пор, пока сигнал потока кислорода не снизится, а затем не стабилизируется. В данном исследовании из скелетных мышц выделяют интактные митохондрии. Затем с помощью респирометрии высокого разрешения измеряют скорость дыхания, зависящую от комплекса I.

Как видно, скорость дыхания митохондрий увеличивается сразу после добавления ADP. После истощения ADP скорость дыхания снижается до уровней, близких к тем, что наблюдались до добавления ADP. Это указывает на то, что отношение состояния 3 к состоянию 4, известное как коэффициент дыхательного контроля (RCR), высоко и что целостность митохондрий хорошо сохранена в процессе процедуры выделения.

Затем измеряют скорость дыхания, зависящую от комплекса II, путем ингибирования дыхания с участием комплекса I с помощью ротенона и введения сукцината в качестве субстрата комплекса II. Затем добавляют ADP, что приводит к немедленному увеличению интенсивности дыхания. После исчерпания ADP интенсивность дыхания снижается до уровней, близких к тем, что наблюдались до добавления ADP, что указывает на высокий RCR и свидетельствует о хорошем сохранении целостности митохондрий в процессе выделения.

Скорость дыхания, зависящая от комплекса IV, определяют путем добавления аскорбата, TMPD и ADP. Затем добавляют азид натрия для ингибирования комплекса IV. Разница в потреблении кислорода до и после добавления азида натрия интерпретируется как истинное дыхание с участием комплекса IV. Высокая скорость дыхания, зависящая от комплекса IV, наблюдаемая в состоянии 3, указывает на то, что целостность митохондрий хорошо сохранена в процессе процедуры выделения.

После освоения эта методика может быть выполнена менее чем за полтора часа при условии правильного проведения. При выполнении данной процедуры важно не забыть заранее провести калибровку датчиков кислорода перед гомогенизацией. После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как измерение содержания клеточного ADP, митохондриального мембранного потенциала, ферментативной активности АТФ-синтазы или уровней субстратов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, связаны ли изменения скорости дыхания с нехваткой митохондриального субстрата, мембранным потенциалом или снижением ферментативной активности АТФ-синтазы.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделить митохондрии из скелетных мышц методом дифференциального центрифугирования и как измерить скорость дыхания митохондриальных комплексов I, II и IV с помощью респирометрии высокого разрешения. После своей разработки этот метод открыл исследователям в области энергетического метаболизма митохондрий путь к изучению энергетической функции митохондрий в таких областях, как генетические митохондриальные заболевания, миопатии, ишемически-реперфузионное повреждение в изолированных митохондриях. Не забывайте, что работа с антимицином А, ротеноном, азидом натрия и FCCP может быть крайне опасной.

При выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток и лабораторных халатов.