Выделение неповрежденном Митохондрии из скелетных мышц с помощью дифференциального центрифугирования для измерения респирометрии высокого разрешения

Общая цель этой процедуры заключается в выделении митохондрий скелетных мышц путем дифференциального центрифугирования и определении частоты дыхания комплексов митохондриальной дыхательной цепи I, II и IV. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области митохондриальной биоэнергетики, такие как заболевания и синдромы, связанные с митохондриальной дисфункцией, такие как различные неврологические заболевания, сепсис и возрастные расстройства. Основным преимуществом данной методики является отсутствие в выделенном митохондриальном препарате большинства цитологических факторов, которые могут мешать анализу функций митохондрий. Демонстрировать процедуру будет Сандра Нансоз, техник из моей лаборатории.

Чтобы начать эту процедуру, возьмите стакан с образцами скелетных мышц, как указано в текстовом протоколе. Поместите стакан на ведерко со льдом. С помощью тонких ножниц измельчите мышцу на кусочки размером один-два миллиметра.

Далее дважды промойте фарш ледяным изоляционным буфером, используя 20 миллилитров на каждую стирку. Суспендируйте промытую салфетку в 10 миллилитрах изоляционного буфера на грамм ткани, а затем добавьте пять миллиграммов протеазы-G ткани. Затем поместите стакан на ледяную баню с магнитной мешалкой и помешивайте в течение 10 минут.

После этого разбавьте суспензию дополнительными 10 миллилитрами изоляционного буфера с добавлением 0,2% обезжиренного BSA на грамм ткани. Затем сцедите весь изоляционный буфер из стакана. Дважды промойте салфетку ледяным изолирующим буфером с добавлением 0,2% BSA, используя 20 миллилитров для каждой стирки.

Затем повторно суспендируйте ткань в 10 миллилитрах выделенного буфера, дополненного BSA, на грамм ткани. Используйте полуавтоматический гомогенизатор стекла со свободно прилегающим пестиком для гомогенизации ткани. Затем перенесите гомогенат в центрифужную пробирку и центрифугируйте при температуре 10 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

С помощью серологической пипетки выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу с 10 миллилитрами ледяной изолирующей среды с добавлением BSA на грамм ткани. Центрифугируйте суспензию при 350 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

После этого используйте серологическую пипетку, чтобы зарезервировать надосадочную жидкость, отбросив гранулу. Отфильтруйте надосадочную жидкость в стакан, который держит на льду через два слоя марли. Переложите отфильтрованную суспензию в центрифужную пробирку и центрифугируйте в 7 000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

Затем выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте сырую митохондриальную гранулу в пяти миллилитрах изолирующего буфера, дополненного БСА, на грамм ткани. Центрифугируйте эту суспензию в 7 000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

Далее выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 20 миллилитрах буфера для стирки. Центрифугируйте при 7 000 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Повторите процесс повторного суспензирования и центрифугирования еще раз.

После этого выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре буфера для стирки. Определяют концентрацию белка с помощью любого стандартного метода. Затем держите концентрированную митохондриальную суспензию на льду до тех пор, пока не будете готовы к проведению респирометрических анализов.

Для начала повторно суспендируйте митохондриальный концентрат в дыхательном буфере до конечной концентрации 0,4 миллиграмма на миллилитр митохондриального белка. Далее отсасывайте дыхательную среду из откалиброванной воздухом камеры оксиграфа. Добавьте 2,1 миллилитра изолированной митохондриальной суспензии.

Вставьте пробку, чтобы закрыть камеру оксиграфа. Затем непрерывно перемешивайте митохондриальную суспензию со скоростью 700 об/мин при 37 градусах Цельсия. Записывайте клеточное дыхание на исходном уровне в течение трех-пяти минут до тех пор, пока не будет достигнут стабильный сигнал потока кислорода.

Чтобы начать сложное I-зависимое дыхание, введите 12,5 микролитров 0,8 молярного малата в оксиграфическую камеру, приготовленную из изолированной митохондриальной суспензии, через титановый инъекционный порт пробки. Затем введите 10 микролитров глутамата двух моляров. Записывайте клеточное дыхание в течение трех-пяти минут до тех пор, пока не будет достигнут стабильный сигнал потока кислорода.

После этого вводят 10 микролитров 0,05 молярного АДФ в камеру через инъекционный порт. Записывайте клеточное дыхание до тех пор, пока сигнал потока кислорода не увеличится, затем не уменьшится и не стабилизируется. Для сложного II-зависимого дыхания вводят два микролитра 0,2 миллимолярного ротенона в камеру оксиграфа, приготовленную с изолированной митохондриальной суспензией.

Записывайте клеточное дыхание до тех пор, пока не будет достигнут стабильный сигнал потока кислорода. Затем введите 20 микролитров одного молярного сукцината. Записывайте клеточное дыхание до тех пор, пока не будет достигнут стабильный сигнал потока кислорода.

После этого вводят 10 микролитров 0,05 молярного АДФ в камеру через инъекционный порт. Записывайте клеточное дыхание до тех пор, пока сигнал потока кислорода не увеличится, затем не уменьшится и не стабилизируется. Для комплексного IV-зависимого дыхания вводят 2,5 микролитра 0,8 миллимолярного аскорбата в камеру оксиграфа, приготовленную с изолированной митохондриальной суспензией.

Далее немедленно вводят 2,5 микролитра 0,2 моляра ТМПД и 10 микролитров 0,05 молярного АДФ. Записывайте клеточное дыхание до тех пор, пока не будет достигнут стабильный сигнал потока кислорода. Затем введите 10 микролитров одного молярного азида натрия.

Записывайте клеточное дыхание до тех пор, пока сигнал потока кислорода не уменьшится, а затем не стабилизируется. В этом исследовании интактные митохондрии были выделены из скелетных мышц. Сложные I-зависимые частоты дыхания затем измеряются с помощью респирометрии с высоким разрешением.

Как видно, частота митохондриального дыхания увеличивается сразу после добавления АДФ. Частота дыхания снижается после истощения АДФ до уровней, аналогичных тем, которые наблюдались до добавления АДФ. Это указывает на то, что соотношение состояний 3 и 4, известное как коэффициент респираторного контроля, или RCR, является высоким и что целостность митохондрий хорошо сохраняется во время процедуры изоляции.

Затем наблюдают частоту дыхания, зависящую от комплекса II, путем ингибирования комплексного I-дыхания ротеноном и введения комплексного субстрата II-субстрата сукцината. Затем добавляется АДФ, что приводит к немедленному усилению дыхания. После истощения АДФ дыхание снижается до уровней, аналогичных тем, которые наблюдались до добавления АДФ, что указывает на высокий RCR, поскольку митохондриальная целостность хорошо сохраняется во время изоляции.

Сложные IV-зависимые частоты дыхания наблюдаются при добавлении аскорбата, ТМПД и АДФ. Затем к комплексу IV добавляется азид натрия. Разница в потреблении кислорода до и после добавления азида натрия интерпретируется как реальное комплексное внутривенное дыхание. Высокая частота комплексного IV-зависимого дыхания, наблюдаемая в состоянии 3, указывает на то, что целостность митохондрий сохраняется во время процедуры изоляции.

После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за полтора часа, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что перед гомогенизацией необходимо заранее выполнить калибровку датчиков кислорода. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как измерение клеточного содержания АДФ, потенциала митохондриальной мембраны, ферментативной активности АТФ-синтазы в качестве уровня субстрата, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, связаны ли изменения частоты дыхания с недостатком митохондриального субстрата, мембранным потенциалом или снижением ферментативной активности АТФ-синтазы.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить митохондрии из скелетной мышцы с помощью дифференциального центрифугирования и как измерить частоту дыхания митохондриальных комплексов I, II и IV с помощью респирометрии высокого разрешения. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области митохондриального энергетического метаболизма к изучению энергетической функции митохондрий в таких областях, как генетические митохондриальные заболевания, миопатии, ишемическое реперфузионное повреждение в изолированных митохондриях. Не забывайте, что работа с антимицином А, ротеноном, азидом натрия и FCCP может быть крайне опасной.

И во время выполнения этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и лабораторных халатов.