Сублимация DAN Матрицы для обнаружения и визуализации ганглиозидов в Rat ткани головного мозга для MALDI масс-спектрометрии изображений

Общая цель этого протокола сублимации заключается в том, чтобы обеспечить подробный, простой для понимания процесс подготовки образцов для обнаружения ганглиозидов в экспериментах по масс-спектрометрии с визуализацией MALDI. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, включая анатомическое распределение и функцию ганглиозидов, как в здоровом мозге, так и при патологии мозга. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть адаптирована для высококачественной визуализации многих видов липидов с небольшими изменениями в протоколе.

Чтобы начать эту процедуру, извлеките мозговую ткань у крысы и подготовьтесь к криостату, как описано в текстовом протоколе. Затем поместите ткань в криостатик. Разрез ткани до желаемого анатомического расположения.

Убедитесь, что толщина резки составляет от восьми до 12 микрон. С помощью криостата с помощью стабилизатора поперечной устойчивости медленно разрежьте разрез расплющенной ткани. Отверстия или отметины на ткани могут появиться при неправильном размещении дуги безопасности или при затупившемся лезвии.

Переместите салфетку к центру платформы для нарезки с помощью чистых кистей для рисования. Чтобы картировать ткань, заморозьте проводящие предметные стекла или металлические пластины, поместив их в криостат во время разреза. Когда предметное стекло полностью замерзнет, осторожно переместите ткань среза на проводящую службу предметного стекла с помощью чистых малярных кистей.

После того, как все срезы ткани будут правильно расположены на предметном стекле, поместите палец под предметное стекло напротив ткани и нажимайте, пока срез не оттает. Затем поместите предметные стекла с салфеткой в эксикатор на пять-10 минут. В качестве альтернативы используйте теплую горку и слегка прижмите ее проводящей стороной вниз к сплющенным участкам ткани.

Работая в вытяжном шкафу, поставьте песочную ванну в алюминиевой емкости на конфорку. Конфорка должна находиться на металлическом ножничном подъемнике соответствующей площади поверхности. Включите конфорку и установите температуру 140 градусов по Цельсию.

Используйте датчик температурной обратной связи для контроля температуры песка на протяжении всего эксперимента и обеспечения постоянства температуры. Далее поместите 300 миллиграммов матрицы DAN на нижнюю поверхность сублимационного аппарата. Разложите матрицу ровным слоем по центру аппарата до примерной ширины и длины сублимируемого предметного стекла.

Поместите металлическую пластину на внутреннюю поверхность аппарата так, чтобы пластина соприкасалась непосредственно с нижней частью конденсатора. Заклейте лентой заготовку тестового предметного стекла по диагонали через поверхность металлической пластины, при этом скотч поместите на внешние края предметного стекла. Соедините верхнюю и нижнюю части устройства резиновым уплотнительным кольцом посередине, чтобы обеспечить полную герметизацию.

Поместите металлический U-образный шарнир вокруг центра аппарата и затяните тиски до тех пор, пока верхняя и нижняя половина аппарата не будут плотно прилегать друг к другу. Затем поместите аппарат в металлическое уплотнительное кольцо вокруг песчаной ванны. Далее поместите в конденсатор горсть колотого льда.

Заполните конденсатор на четверть или половину холодной водой, чтобы создать ледяную слякоть. Ледяная жижа охладит металлическую пластину с внутренней стороны аппарата, а впоследствии и прилипшую к ней горку. Подождите не менее пяти минут, чтобы температура достигла устойчивого состояния.

Затем налейте 300 мл метанола в контейнер с холодной ловушкой и поместите стеклянную посуду в контейнер. Подключите вакуумный насос к выходу холодной ловушки с помощью резиновой трубки. Используйте еще один кусок резиновой трубки для подключения входа холодной ловушки к сублимационному аппарату.

Убедитесь, что трубка плотно закреплена с помощью металлических зажимов. Используйте вакуумный насос для создания вакуума от 30 до 50 миллиторр. Дайте насосам поработать не менее пяти минут для выравнивания давления.

Бросьте два-три небольших кусочка сухого льда в этанол на дно контейнера с холодной ловушкой. Холодная ловушка помогает предотвратить накопление частиц матрицы в вакуумном насосе. Тиски на U-образном кольце сублимационного аппарата могут потребовать затяжки после включения вакуумного насоса из-за снижения давления в аппарате.

Следите за тем, чтобы температура песчаной ванны стабилизировалась на уровне 140 градусов по Цельсию. Также убедитесь, что вакуум включен и что аппарат закреплен в металлическом уплотнительном кольце над песчаной ванной со всеми подключенными трубками. Установите таймер на семь минут, но не запускайте таймер.

Медленно поднимите ножничный подъемник и песочную ванну к сублимационному аппарату, пока U-образный шарнир сублиматора не окажется значительно выше металлического уплотнительного кольца. Это дополнительное пространство позволяет регулировать аппарат на песке. Быстро надавите сублиматором аккуратно на поверхность песка, чтобы убедиться, что аппарат ровно сидит на песке.

А затем, сразу запускаем таймер. Когда сработает таймер, выключите вакуумный насос и осторожно опустите ножничный подъемник до тех пор, пока сублиматор больше не будет касаться песчаной ванны и надежно сидеть в металлическом уплотнительном кольце. Медленно ослабьте микровентиляционный клапан, чтобы сбросить давление в аппарате.

Ослабьте металлический зажим вокруг резиновой трубки сублимационного аппарата, и медленно начните ослаблять трубку. После того, как резиновая трубка будет слегка ослаблена, согните трубку в одну сторону, чтобы позволить остаточному давлению уйти. Когда давление окружающей среды вернется, осторожно снимите резиновую трубку с сублимационного аппарата.

Далее ослабьте тиски на U-образном шарнире аппарата и снимите их. Осторожно разделите две половины сублимационного аппарата и снимите предметное стекло с верхней части внутренней стеклянной посуды. Изучите слайд, чтобы убедиться в равномерном распределении матрицы.

Если распределение и количество сублимированного матрикса достаточно, наклейте новое предметное стекло с тканью на внутреннюю часть сублиматора и повторите процесс сублимации. Перейдите к выполнению визуализации и анализа, как описано в текстовом протоколе. Масс-спектр отображает ионное содержание анолитов в диапазоне от 1000 до 2000 масс.

Основные ганглиозиды серии А помечены по спектру. Здесь показано соответствующее молекулярное изображение ганглиозидов в мозге крысы. Молекулярное изображение показывает анатомическое распределение нескольких видов ганглиозидов с помощью цветового кодирования, которые были наложены и псевдоокрашены с помощью программного обеспечения ImageJ.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, так как в процессе подготовки образцов существует множество переменных, которые могут повлиять на качество результатов IMS и которые часто не учитываются в отчетных протоколах. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что после каждого эксперимента нужно следить за количеством сублимируемой матрицы и соответствующим образом изменять время сублимации для предметного стекла. После своего развития этот метод проложил путь исследователям к изучению роли мембранных липидов, таких как ганглиозиды, после черепно-мозговой травмы, болезни Нер-Джона и естественного процесса старения.

Этот метод может дать представление об изобилии и анатомическом распределении липидов в мозге, он также может быть применен к другим системам, включая ткани за пределами мозга, и даже модели растений и насекомых. Работа с поврежденными корнями может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует принимать меры предосторожности, такие как перчатки, маски и средства защиты глаз.