Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена

Общая цель этого видео — описать метод секвенирования псораленовых, сшитых лигированных и выбранных гибридов или SPLASH, в котором попарные взаимодействия РНК-РНК in vivo картируются на уровне всего генома. Этот метод представляет собой простой и высокопроизводительный метод картирования взаимодействия РНК in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области геномики РНК, например, как различные участки вдоль одной цепи РНК или между разными цепями РНК взаимодействуют друг с другом.

Хотя этот метод может дать представление о дрожжах и клетках человека, он также может быть применен для исследований других современных организмов, включая бактерии и мембраны в клетках. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы хотели придумать способ картирования молекулярного взаимодействия. Обратите внимание, что следующая процедура содержит несколько точек остановки.

В такие моменты эксперимент может быть приостановлен на короткое время или на неопределенный срок. Подробности можно найти в сопроводительном тексте. Начните эту процедуру с двукратного промывания клеток HeLa пятью миллилитрами PBS.

Поставьте тарелку вертикально на одну минуту, чтобы полностью слить лишний PBS. Далее добавьте один миллилитр PBS, содержащий 200 микромолярных биотинилированных псоралена и 0,01% дигитонина, который увеличивает проницаемость клеток. Позаботьтесь о том, чтобы раствор был равномерно нанесен на поверхность клеток.

Выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. После инкубации снимите крышку с посуды и поместите ее на лед внутри УФ-сшивателя на расстоянии трех сантиметров от УФ-лампы. Облучайте ультрафиолетовым излучением 365 нанометров в течение 20 минут.

Через 20 минут извлеките чашку из сшивающего агента, а затем изолируйте фрагмент и осадите РНК из клеток HeLa в соответствии с инструкциями в сопроводительном документе. Загрузите денатурированный лестничный раствор и образцы РНК в гель площадью 8,6 сантиметра площадью 6% TBE-мочевины. Размер фракционируют электрофорезом при напряжении 180 вольт в течение 40 минут.

Окрашивайте гель в 10 миллилитров буфера TBE, содержащего разведение нуклеиновой кислоты в соотношении 1:10 000, в течение пяти минут в темноте. Пока гель окрашивается, используйте иглу 24 калибра, чтобы проколоть чистую 0,6-миллилитровую микропробирку на дне. Поместите его в двухмиллилитровую микрофужную пробирку.

С помощью трансиллюминатора визуализируйте полосы на геле после окрашивания и вырежьте срез геля, соответствующий от 90 до 110 нуклеотидов. Перенесите срез геля в проколотую пробирку для микрофуги объемом 0,6 миллилитра в двухмиллилитровую пробирку для микрофуги. Подбор размеров позволяет установить минимальную длину химерных фрагментов и в дальнейшем различать лигированные продукты и нелигированные.

Центрифугируйте гелевые срезы при 12 000 г при комнатной температуре в течение двух минут, чтобы измельчить гелевый ломтик и собрать его в двухмиллилитровую микропробирку. После отжима выбросьте пустую 0,6-миллилитровую микрофуговую пробирку. К измельченному гелевому ломтику добавьте 700 микролитров элюирующего буфера.

Инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи при постоянном вращении, чтобы обеспечить диффузию образцов в буфер. Переложите срезы геля и буфер для элюирования в фильтр центрифуги и центрифугируйте при 20 000 раз больше g в течение 20 минут. После отжима срезы геля будут застрять в верхнем отсеке фильтра, который можно выбросить.

Осаждение и количественное определение РНК в соответствии с описанием в сопроводительном документе. Мгновенно заморозьте и храните РНК при температуре минус 80 градусов Цельсия в жидком азоте до тех пор, пока она не будет использована. Чтобы обогатить участки сшивки РНК, начните с добавления 100 микролитров лизисного буфера, содержащего ингибитор РНКазы, для промывки магнитных шариков, покрытых стрептавидином в микрофуговой пробирке.

В коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров добавьте два миллилитра свежеприготовленного гибридизационного буфера, один миллилитр обогащенного лизизационного буфера, 1,5 микрограмма фракционированной РНК и 100 микролитров ресуспендированных гранул. Осторожно перебейте трубку. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут с вращением встык.

После инкубации пять раз промойте бусины с предварительно подогретым буфером для стирки. В конце пятой промывки поместите микропробирку с шариками на магнитную подставку на одну минуту, а затем снимите буфер для промывки. Добавьте в промытые шарики один миллилитр холодного буфера полинуклеотидкиназы Т4.

Инкубируйте бусины в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия с вращением встык. Поместите микрофуг-пробирку, содержащую шарики, на магнитную полосу. Через минуту аккуратно снимите буфер.

Повторите этот шаг в общей сложности два раза и снимите буфер после последней стирки. Затем следуйте инструкциям в сопроводительном документе, чтобы преобразовать пять простых и три простых конца в совместимые с лигированием и выполнить близкую лигацию. После промывки добавьте 100 микролитров РНК-буфера в шарики и повторно суспендируйте их, пипетируя вверх и вниз.

Нагрейте образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут на термоблоке. Далее охладите образец на льду в течение одной минуты. Добавьте в пробу 500 микролитров тиоцианата-фенол-хлороформа гуанидиния.

Перемешивайте, энергично помешивая в течение 10 секунд. Выдержать смесь при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации используйте набор для осаждения, очистки и восстановления РНК, чтобы убедиться, что даже небольшие РНК сохранены.

Разбавьте РНК в 100 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз. Перелейте 100 микролитров элюированных образцов в лунку 24-луночного планшета на NICE. Удерживая образец на льду, ультрафиолетом облучают его на 254 нанометрах в течение пяти минут.

Перенесите образец с обратной сшивкой в чистую пробирку для микрофугов. Добавьте 10 микролитров ацетата натрия, один микролитр гликогена и 300 микролитров 100% этанола. Осаждите РНК при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение не менее одного часа.

Чтобы извлечь РНК, центрифугируйте осажденную РНК при 20 000 g в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. После отжима удалите надосадочную жидкость и добавьте один миллилитр 70% холодного этанола, чтобы промыть гранулы РНК. Центрифугируйте промытую гранулу при 20 000 раз г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Снимите промывочный буфер и добавьте 4,25 микролитра воды, не содержащей нуклеаз, чтобы ресуспендировать РНК. Перенесите РНК в ПЦР-пробирку объемом 0,2 миллилитров. Наконец, выполните обратную транскрибацию, циркуляризацию и амплификацию кДНК в соответствии с инструкциями в сопроводительном документе.

На этой схеме изображен рабочий процесс SPLASH. После добавления биотинилированного псоралена в присутствии 0,01% дигионина и УФ-сшивки из клеток извлекают общую РНК и проводят точечную блоттинг, чтобы убедиться в эффективности сшивания. Затем биотинилированные олигонотиды с 20 основаниями используют в качестве положительного контроля для титрования количества биотинилированного псоралена, добавляемого в клетки, таким образом, что примерно одно из каждых 150 оснований сшито.

Затем проводится маломасштабная ПЦР-амплификация с использованием возрастающего числа циклов ПЦР для определения минимального числа циклов, необходимого для глубокого секвенирования. В эффективном процессе подготовки библиотеки библиотека секвенирования кДНК может быть амплифицирована из 1,5 микрограмма выбранной РНК менее чем за 15 циклов амплификации ПЦР. Затем библиотека секвенируется с использованием двух прочтений по 150 пар оснований на машине с высоким уровнем секвенирования.

Затем последовательные чтения обрабатываются в соответствии с вычислительным конвейером. Конечным результатом является список отфильтрованных химерных взаимодействий, который включает в себя как внутримолекулярные, так и межмолекулярные взаимодействия РНК-РНК в транскриптоме. При попытке проведения этой процедуры важно не забывать проверять включение биотинилированного псоралена при использовании SPLASH на новых организмах.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии РНК к изучению взаимодействий РНК в различных организмах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создать библиотеку секвенирования, которая фиксирует попарные взаимодействия РНК глобально в клетке.