целевое В Ситу мутагенеза гистона Гены в почкующихся дрожжах

Общая цель этой процедуры заключается в генерировании специфических мутаций в генах гистонов в их эндогенном хромосомном расположении в почковающихся дрожжевых клетках. Этот метод может быть использован для определения вклада специфических остатков гистонов в различные процессы, использующие хроматин в качестве субстрата, такие как транскрипция ДНК, каждая комбинация. Основное преимущество этого метода заключается в том, что специфические гены гистонов могут быть нацелены на мутагенез, несмотря на то, что у дрожжей каждый белок гистона кодируется двумя высокогомологичными, неаллельными генами.

После получения штамма дрожжей с нокаутированным геном-мишенью гистона и замещенным на URA3 получить продукты ПЦР для двух частично перекрывающихся фрагментов гена гистона-мишени, настроив следующую реакцию для первой половины гена. Для второй половины гена настройте аналогичную реакцию ПЦР с использованием разных праймеров. Поместите реакции в амплификатор и настройте следующую программу.

Запустите от 20 до 50 микролитров ПЦР-реакций на агарозном геле с низкой температурой плавления 0,9% в буфере TBE. Затем с помощью чистого лезвия бритвы вырежьте продукты ПЦР из геля и перенесите каждую секцию в пробирку объемом 1,5 миллилитра. Храните кусочки агарозы при температуре 20 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.

Чтобы получить матрицу ДНК для ПЦР-реакций с получением полноразмерных продуктов ПЦР, расплавьте участки агарозы в термоблоке при температуре 65 градусов Цельсия в течение пяти минут. Вортексируйте трубки каждые одну-две минуты, чтобы помочь плавлению. Перелейте определенное количество расплавленной агарозы из каждого образца в одну микроцентрифужную пробирку и перемешайте пробирку путем вортексирования.

Используйте его в качестве шаблона для fusion PCR и храните при температуре 20 градусов Цельсия до использования. Чтобы амплифицировать большое количество полноразмерного ПЦР-продукта, настройте шесть ПЦР-реакций с использованием следующих реагентов. Поместите пробирки в амплификатор и запустите реакции со следующими настройками.

Продукты ПЦР концентрируют путем осаждения и используют их для котрансформации с основной плазмидой в соответствии с текстовым протоколом. Для скрининга потери гена URA3 в результате интеграции продукта ПЦР репликацию клеток планшета с пластин с 1 по 20 путем снятия крышки планшета и прижатия пластины, содержащей колонии, к стерильному бархату. Перенесите ячейки из бархата в пластину 5-FOA, прижав пластину к бархату.

Выдерживайте пластины при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух суток. Затем внимательно осмотрите пластины на предмет роста. После полос и инкубации колоний-кандидатов на планшетах YPD в соответствии с текстовым протоколом, повторите каждую очистительную пластину YPD на свежую пластину YPD, на пластину с отсечкой без урацила для проверки на потерю гена URA3 и вторую пластину для контроля наличия или отсутствия плазмиды позвоночника.

После инкубации определите колонию из каждого образца-кандидата, которая растет на пластине YPD, но не растет ни на одной из пластин с выпадением. Переложите эти колонии на свежие пластины YPD. Как утверждается, для правильной интеграции мутантного аллеля с помощью ПЦР по текстовому протоколу.

На этом рисунке показаны результаты ПЦР для получения двух частично перекрывающихся фрагментов HHT2 с желаемыми мутациями, которые в конечном итоге приводят к изменению кодона AGA на GAA, приводящему к мутации R53E. Здесь проиллюстрирован результат термоядерной ПЦР-реакции, в результате которой были получены полноразмерные продукты ПЦР. Полноразмерные ПЦР-продукты содержали 195 и 220 областей пар оснований, гомологичных областям до и после открытой рамки считывания HHT2 соответственно для стимулирования гомологичной рекомбинации.

В этом примере трансформации полноразмерные продукты ПЦР котрансформировали с меченой HIS-3 плазмидой, а трансформанты выбирали на планшетах, в которых отсутствовал гистидин. Затем ГИС положительные колонии были проверены на устойчивость к 5-FOA. Показаны примеры кандидатов, а также выборки, которые вряд ли будут представлять желаемые интеграционные события.

Идентифицировано 12 образцов-кандидатов, которые были подвергнуты ПЦР-анализу на замещение гена URA3 мутантными продуктами ПЦР. Четыре кандидата показали интеграцию ПЦР-продукта в нужном месте. Один из этих кандидатов показан на четвертой дорожке.

Поскольку мутация AG2GA генерирует новый сайт рестрикции EcoR1, расщепление с EcoR1 было проведено на одном из успешных образцов интеграции ПЦР, чтобы продемонстрировать, что мутантная последовательность действительно была включена в геном. Как только все реагенты будут доступны, станет возможным получить дрожжевые клетки, несущие желаемые мутации гистонов, в течение 15-20 дней. После того, как желаемая мутация была сгенерирована в штамме-хозяине, клетки, экспрессирующие целевой белок гистон исключительно из мутагенизированного гена, могут быть получены путем соответствующих генетических скрещиваний.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что периметры для ПЦР-реакций могут потребоваться корректировки в зависимости от характера конкретных праймеров, используемых в экспериментах, и ожидаемых размеров продуктов ПЦР. Хотя эта процедура хорошо подходит для мутагенеза гена гистонов, поскольку она позволяет нацеливаться на конкретный ген гистона, несмотря на наличие второго высокогомологичного, неаллельного гена, она также может быть использована для генерации мутаций в других геномных местах. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как генерировать целевые мутации гистонов NC2 в почковающихся дрожжах, используя комбинацию подходов ПЦР и методов генетики дрожжей.

Не забывайте, что воздействие ультрафиолетового излучения может быть чрезвычайно опасным, поэтому при работе с УФ-трансиллюминатором всегда следует использовать защитные очки, щитки и одежду. Также надевайте перчатки, очки и защитную одежду на протяжении большинства этапов процедуры.