Внутриклеточные Окрашивание и проточной цитометрии для идентификации субпопуляций лимфоцитов в пределах мышиной аорте, почек и лимфатических узлов в модели артериальной гипертензии

Общая цель этого протокола заключается в получении суспензий одиночных клеток из мышиной аорты, почек и лимфатических узлов для количественной оценки и характеристики иммунных клеток в модели ангиотензин-индуцированной гипертензина II. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сердечно-сосудистых заболеваний, например, какие два субпопуляции лимфоцитов способствуют развитию гипертонии. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет идентифицировать и количественно оценить субпопуляции иммунных клеток в солидных органах на уровне отдельных клеток.

Перед началом процедуры продезинфицируйте мышиную грудь 70%-ным этанолом. Затем с помощью ножниц осторожно вскройте кожу и грудную стенку, чтобы обнажить сердце. Чтобы перфузировать сосудистую сеть, сделайте небольшой разрез в правом предсердии и неуклонно вводите не менее 10 миллилитров холодного PBS со скоростью примерно один миллилитр в секунду в верхушку левого желудочка.

Когда все органы побледнеют, используйте тонкорассекающие щипцы для удаления лимфоузлов, дренирующих брюшную аорту, стараясь не разорвать капсулы. Под препарирующим микроскопом извлеките две почки тонкими ножницами. Затем с помощью тонких изогнутых ножниц рассеките всю грудную и брюшную аорту, начиная с сердца и заканчивая бифуркацией подвздошной кости, заботясь о том, чтобы окружающий периваскулярный жир прикреплялся к аорте.

Затем перенесите почки в диссоциационную трубку, содержащую 10 миллилитров раствора для переваривания почек, и используйте полуавтоматический диссоциатор для механической дезагрегации почечной ткани в соответствии с инструкциями производителя. В конце диссоциации инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия при непрерывном вращении. Через 20 минут немедленно прекратить ферментативное сбраживание холодной средой RPMI 1640 с добавлением 5% FBS и отфильтровать полученную тканевую кашицу через 40-микронное ситечко в 50-миллилитровую коническую трубку.

Используйте поршень из одномиллилитрового шприца, чтобы раздразнить остатки ткани. Затем гранулируйте клетки методом центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в трех миллилитрах градиентной среды 36% плотности и перенесите клетки в 15-миллилитровую коническую трубку.

Аккуратно нанесите три миллилитра градиентной среды 72% плотности под клетки, стараясь не нарушить слои, и разделите клетки центрифугированием. Иммунные клетки будут расположены на границе раздела. Удалите самый верхний желтоватый слой, содержащий клеточный мусор, а затем доведите объем до 15 миллилитров с помощью холодного PBS.

Хорошо встряхните, чтобы разрушить градиент, а затем промойте клетки центрифугированием. Чтобы изолировать иммунные клетки аорты, перенесите аорту в двухмиллилитровую трубку, содержащую один миллилитр свежеприготовленного раствора для пищеварения аорты, на льду и с помощью тонких ножниц измельчите всю аорту на мелкие кусочки. Затем инкубируйте фрагменты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут непрерывного вращения.

В конце разложения добавьте холодный RPMI с добавлением 5% FBS в пять раз больше объема раствора для сбраживания и отфильтруйте полученную тканевую кашицу через 40-микронное ситечко. Затем соберите одноклеточную суспензию центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в свежем RPMI с FBS. Чтобы получить одноклеточную суспензию из дренирующих аортальные лимфатические узлы, перенесите лимфатические узлы на 40-микронный фильтр в чашке для культуры тканей размером 60 на 15 миллиметров и используйте одномиллилитровый поршень шприца для дезагрегации ткани.

Затем промойте ситечко двумя миллилитрами RPMI плюс FBS и перенесите освобожденные клетки в 15-миллилитровую коническую трубку. Чтобы стимулировать клетки, сначала отрегулируйте концентрацию каждой клеточной суспензии до концентрации от 10 до 10-6 клеток на миллилитр в среде для культивирования клеток. Затем добавьте по два микролитра коктейля активации клеток в каждую группу клеток на каждый миллилитр среды.

Затем перенесите один-два раза от 10 до шестой клетки аорты или почки на лунку в 12-луночный планшет и от одного до двух раз по 10 до шестого количества клеток лимфатических узлов на лунку в 24-луночный планшет. Поместите тарелки в инкубатор с увлажненным углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на три часа. Затем пересадите элементы в соответствующие полистирольные трубки FACS и гранулируйте их путем центрифугирования.

После двукратной промывки ячеек свежим буфером FACS в одинаковых условиях центрифуги необходимо провести блочную и неспецифическую поверхностную связь с блоком FC и промыть ячейки в PBS. Ресуспендируйте гранулы в одном миллилитре свежего PBS и окрашивайте клетки одним микролитром амино-реактивного окрашивателя жизнеспособности в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия в защищенном от света месте. В конце инкубации промойте клетки еще два раза в одном-двух миллилитрах буфера FACS и повторно суспендируйте гранулы в 100 микролитрах соответствующего коктейля антител, окрашивающих клеточную поверхность.

Через 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия и в защищенном от света месте промойте клетки еще два раза в двух миллилитрах свежего буфера FACS, а также зафиксируйте и пропитайте клетки с помощью набора для фиксации и пермеабилизации в соответствии с инструкциями производителя. Затем пометьте клетки интересующим вас внутриклеточным коктейлем антител и снова промойте клетки в буфере FACS. Для проточного цитометрического анализа стимулированной продукции внутриклеточных цитокинов сначала прогоните неокрашенные и одинарно окрашенные контрольные пробирки для корректировки спектрального перекрытия, а затем контрольные пробирки с флуоресценцией минус один для каждого флуорофора на панели.

После того, как основные параметры флуоресцентного анализа установлены, используйте график области рассеяния, направленный вперед, чтобы установить первичные ворота для обнаружения популяции лейкоцитов, с последующим стробированием для исключения мертвых клеток в соответствии с их отсутствием экспрессии жизнеспособности-окрашивания. Нанесите на график прямую зону рассеяния относительно высоты переднего рассеивания и строба, чтобы исключить дублеты. Затем лейкоциты могут быть идентифицированы по их экспрессии CD45.

Для определения присутствия Т-клеток, продуцирующих IL-17A или IL-17F, в почках или аорте мышей могут быть получены суспензии одиночных клеток, как показано только что для контрольного анализа флуоресценции каждого цитокина. Как и ожидалось, очень немногие клетки являются положительными на IL-17A или IL-17F в контрольной группе «флуоресценция минус один», что позволяет точно различать положительные и отрицательные сигналы для правильной настройки стробов для идентификации положительных клеток IL-17A или IL-17F в экспериментальных образцах. Репрезентативное внутриклеточное окрашивание Т-клеток, выделенных из почки и аорты мышей дикого типа, которым вводили носитель или ангиотензин II, выявляет наличие подмножества IL-17A или IL-17F-экспрессирующих Т-клеток в обеих тканях.

Кроме того, внутриклеточное окрашивание Т-клеток из лимфатических узлов, дренирующих аорту, демонстрирует, что CD8-положительные Т-клетки экспрессируют интерферон гамма и Т-бет после стимуляции ангиотензина II. После освоения этой техники она может быть выполнена за шесть-девять часов в зависимости от количества обрабатываемых тканей. При выполнении этой процедуры важно работать быстро и эффективно, чтобы свести к минимуму гибель клеток.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получить суспензию одиночных клеток из почек, аорты и лимфатических узлов мыши, а также охарактеризовать и количественно определить субпопуляции иммунных клеток из этих органов. Этот метод позволяет сердечно-сосудистой и почечной физиологии исследовать изменения в популяциях иммунных клеток, которые могут способствовать гипертонии и другим провоспалительным заболеваниям.