Геном Редактирование и Направленная дифференцировка hPSCs для Допрос Lineage Факторы, определяющие в развитии человеческого потенциала Панкреатического

Этот протокол демонстрирует, как создать платформу iCRISPR для быстрого редактирования генома в hPSCs, а также как включить отредактированные линии генома в дифференцировку поджелудочной железы, направленную на hPSC, для изучения развития и заболеваний поджелудочной железы человека. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области развития поджелудочной железы человека, такие как генетический контроль нормального развития поджелудочной железы и молекулярные основы диабета. Основное преимущество этих методов заключается в том, что они позволяют нам эффективно модифицировать гены, представляющие интерес для hPSCs, и использовать эти модифицированные клеточные линии для изучения развития и заболеваний поджелудочной железы человека in vitro.

Культивирование hPSCs в химически определенных и безпитательных условиях на усеченной посуде человека, покрытой витронектином. За день до электропорации добавьте 10 микромолярного ингибитора ROCK во время смены среды. В день электропорации заранее приготовьте 10-сантиметровую посуду, покрытую витронектином.

Затем удалите питательную среду из клеток, промойте один раз PBS без кальция и магния, затем обработайте клетки реагентом для диссоциации 1X при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно трех минут. Далее аспирируйте диссоциативный реагент до того, как клетки отделятся, и добавьте 10,5 миллилитров готовой среды. Используйте щадящее пипетирование для формирования одноклеточной суспензии перед переносом в центрифужные пробирки.

Выполните подсчет клеток на 500 микролитрах клеточной суспензии с помощью автоматического счетчика клеток. Затем гранулируйте hPSC в 200 раз больше G в течение пяти минут. Ресуспендируйте клетки в холодном PBS в соотношении 12,5 умножить на 10 до шестой клетки на миллилитр, и распределить в 800-микролитровых объемах.

Добавьте плазмиды в каждую 800-микролитровую суспензию hPSC и хорошо перемешайте. Переложите смесь в кювету с электропорацией 0,4 сантиметра и подержите на льду примерно пять минут. Электропорировать элементы с помощью системы электропорации при напряжении 250 вольт и 500 микрофарадах.

Крайне важно использовать здоровые и размножающиеся ПСК для редактирования генома. После электропорации переложите элементы в коническую трубку объемом 15 миллилитров с пятью миллилитрами предварительно подогретой полной среды, а затем гранулируйте ячейки. Ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах полной среды с 10 микромолярным ингибитором ROCK и нанесите пластину один раз по 10 на шестую, 2,5 раза по 10 на шестую и пять раз по 10 на шестую клетку из каждой электропорации на чашки, покрытые витронектином, так что по крайней мере одна из пластин будет иметь достаточное количество колоний одиночных клеток для выбора.

Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия. На второй день начните отбор неомицина с добавления среды, содержащей 500 мкг сульфата G418 на миллилитр. На шестой день начните выбор пуромицина, добавив среду, содержащую один микрограмм на миллилитр дигидрохлорида пуромицина.

На 10-12 день колонии одиночных клеток hPSC достигают от одного до двух миллиметров в диаметре. На этом этапе выберите от 12 до 24 колоний под стереомикроскопом. Механически разложите колонии hPSC на мелкие кусочки с помощью наконечника для пипетки объемом 200 микролитров и перенесите клетки непосредственно в 24-луночные планшеты, покрытые витронектином.

За 24 часа до трансфекции направляющей РНК обработайте iCas9 hPSCs двумя микрограммами на миллилитр доксициклина. В день трансфекции подготовьте покрытые витронектином 24-луночные планшеты и диссоциируйте клетки iCas9 на одиночные клетки с помощью реагента для диссоциации 1X, как и раньше. Затем гранулируйте клетки в соотношении 200 раз G в течение пяти минут и ресуспендируйте клетки в соотношении 0,5 умножить на 10 до шестой клетки на миллилитр в полной среде, дополненной доксициклином с двумя микрограммами на миллилитр и 10 микромолярным ингибитором ROCK.

Выложите 500 микролитров ресуспендированных клеток в отдельные лунки 24-луночного планшета. Для каждой направляющей РНК сделайте следующие трансфекционные смеси. Смешайте А, 50 микролитров восстановленной сывороточной среды плюс один микролитр направляющей РНК.

Смешайте В, 50 микролитров восстановленной сывороточной среды плюс три микролитра реагента для трансфекции. Соедините смесь А и В, чтобы получилась смесь объемом 100 микролитров, и выдерживайте в течение пяти минут при комнатной температуре. Добавьте 50 микролитров смеси в ячейки в дублирующие лунки 24-луночного планшета и хорошо перемешайте.

Через четыре дня извлеките геномную ДНК, ПЦР амплифицируйте целевые участки, фланкирующие последовательности, нацеленные на направляющую РНК, и оцените эффективность редактирования с помощью расщепления T7E1. Начинайте дифференцировку линий hPSC, когда клетки достигают 80% конфлюенции через два дня после посева. Добавьте дифференциацию в нулевой день и затем ежедневно меняйте среду, используя формулы, показанные здесь.

На 10-й день исследуйте более поздние маркеры PP2-предшественника поджелудочной железы, PDX1 и NKX6.1 путем иммунофлуоресцентного окрашивания подмножества клеток. Затем приступают к культивированию воздушно-жидкостной границы, предварительно обрабатывая клетки PP2 10-микромолярным ингибитором ROCK в течение четырех часов. По истечении времени инкубации диссоциируйте клетки, как и раньше.

Сведите к минимуму продолжительность обработки диссоциативным реагентом для максимизации выживаемости клеток при посеве на этапе дифференцировки на границе раздела воздух-жидкость. Аспирируйте диссоциативный реагент до того, как клетки отсоединятся. Затем добавьте в тарелку 10 миллилитров среды бу-ла и диспергируйте клетки PP2 в отдельные клетки, осторожно пипетируя вверх и вниз.

Соберите одноклеточную суспензию. Подсчитайте количество ячеек и гранулируйте ячейки. После ресуспендирования клеточной гранулы в среде для дифференцировки S5 нанесите от 5 до 10 микролитров клеток на каждую точку на фильтре с трансвеллерной вставкой.

Добавьте среду S5 на дно каждого трансвелл-вкладыша и инкубируйте с изменениями среды до тех пор, пока эндокринные маркеры поджелудочной железы не станут обнаруживаемыми с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. На этом рисунке показано негомологичное соединение концов, опосредованное iCRISPR в hPSCs. Нокаут гена очень эффективен, так как не требует процесса отбора, и можно легко получить от 20% до 50% биаллельных мутантов.

Для эффективных и точных генетических изменений направляющие РНК котрансфицируются с одноцепочечным донором ДНК, несущим специфическое изменение последовательности, показанное красным цветом. Часто, чтобы предотвратить повторное разрезание в модифицированных аллелях, рекомендуется включать тихую мутацию в последовательность PAM, показанную здесь зеленым цветом. С помощью этой системы можно получить примерно 10% клонов, несущих желаемую модификацию генома, направленную на гомологию, без дополнительных изменений в обоих аллелях.

После освоения требуется менее двух месяцев для создания новой линейки iCas9 hPSC. После этого в течение одного-двух месяцев могут быть сгенерированы различные линии мутантных колоний hPSC. Последующая генерация генетических мутантных линий hPSC, поэтапная дифференцировка in vitro мутантных клеточных линий в бета-подобные клетки поджелудочной железы позволяет нам изучить конкретные этапы развития, затронутые этими мутациями, что позволит лучше понять основные механизмы заболевания.