In Vitro Дифференциация человека плюрипотентных стволовых клеток в клетки трофобласта

Общая цель данного протокола заключается в дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток человека в трофобластические клетки человека с использованием костного морфогена4 и ингибиторов активных и узловых сигнальных путей для изучения ранних событий формирования и функционирования плаценты человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении функций трофобластических клеток и того, как эти клетки формируются. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он может производить большое количество трофобластических клеток для широкого спектра применений, включая генетику, и позволяет проводить анализы клеточных функций.

Чтобы начать эксперимент, разморозьте аликвоту внеклеточного матрикса на льду в течение трех-четырех часов. Используя ледяные наконечники, одну холодную 50-миллилитровую коническую трубку и модифицированную равнополую среду Дульбекко, или среду DMEM F12, переносят два миллиграмма внеклеточного матрикса в 24 миллилитра ледяного DMEM F12. Немедленно перенесите 50-миллилитровую коническую трубку в лед и храните ее при температуре четыре градуса Цельсия.

Чтобы покрыть планшеты для культуры тканей, добавьте один миллилитр разбавленного внеклеточного матрикса на лунку шестилуночного планшета. Поворачивайте пластину, чтобы покрыть лунки, и инкубируйте пластину при комнатной температуре не менее одного часа. Аспирируйте внеклеточный матрикс из новой пластины и добавьте мышиную эмбриональную среду, кондиционированную фибробластами, или MEFCM, содержащую bFGF.

С помощью пипетки перенесите соскребленные клеточные зажимы с пластины MEF и поместите их в пластину с покрытием из внеклеточного матрикса. Затем инкубируйте тарелку. Соскребите дифференцированные клетки с помощью пастеровской пипетки перед заменой MEFCM на среду bFGF ежедневно, используя два миллилитра среды для одной лунки.

Когда колонии кажутся большими и яркими под микроскопом, они пропускают hESCs каждые шесть-семь дней. Когда клетки без питателя будут готовы к прохождению, удалите среду и промойте клетки, добавив один миллилитр PBS с помощью пипетки. Аспирируйте PBS и замените его 0,5 миллиграмм на миллилитр предварительно подогретой диспа с помощью пипетки.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. После инкубации промойте клетки PBS, добавив два миллилитра PBS на лунку, и аспирируйте PBS. Добавьте один миллилитр СМ на лунку и вручную соскребите клетки в небольшие комочки с помощью кончика пятимиллилитровой пипетки.

из взвешенных клеток слипаются в новые пластины, покрытые внеклеточным матриксом. Приготовьте среду для дифференцировки. Используйте CM без bFGF и добавьте свежие ингибиторы перед использованием.

Используйте беспитательные чЭСК, выращенные на пластинах, покрытых внеклеточным матриксом, для одного прохода, культивируемого внутри инкубатора, установленного с 5% кислородом. После первого прохода на пластины, покрытые внеклеточным матриксом, дайте клеткам прикрепиться на 24 часа. На следующий день начните дифференцировку, удалив КМ, содержащий bFGF, и заменив его на КМ, содержащий BMP4/A/P, с двумя миллилитрами на лунку в шестилуночном планшете.

Продолжайте культивировать клетки, используя 4% уровень кислорода. Заменяйте CM, содержащую BMP4/A/P, каждые два дня, отсасывая старую среду и добавляя новую среду, содержащую BMP4/A/P. Собирайте клетки в нужные моменты времени.

Культивирование hESCs для двух пассажей на внеклеточном матриксе после переноса их из MEF со средой hESC, содержащей bFGF. Высокая конфлюенция клеток важна, поэтому разделите hESCs один к одному на новую пластину, что обеспечит не менее 50% конфлюенции на следующий день. Инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе с низким содержанием кислорода.

На следующий день замените среду на два миллилитра на лунку дифференцировочной среды. Поместите клетки в инкубатор с низким содержанием кислорода на ночь. Перед трансфекцией желатин обмазать блюдо, добавив в блюдо 0,1% желатина.

Поверните блюдо, чтобы покрыть тарелку, затем оставьте тарелку при комнатной температуре. Через 20 минут удалите желатин. Дифференцируйте клетки до нужного момента времени.

За день до трансфекции трипсинизируйте клетки с использованием 0,05% трипсина в течение пяти минут. Нанесите ячейки на пластину, покрытую желатиновым покрытием, до желаемого слияния. Добавьте CM, содержащий BMP4/A/P, в котором отсутствует bFGF, и инкубируйте культуру в течение ночи.

На следующий день добавьте в клетки свежую среду для дифференцировки. Трансфектируйте миРНК с помощью реагента для трансфекции миРНК. Для анализа плазменной ДНК используйте соответствующий реагент на основе липофектамина.

Следуйте протоколу приема препарата, описанному для каждого реагента для трансфекции. Перенесите комплексы липофектаминов миРНК в каждую лунку или пластину клеток и аккуратно перемешайте. Затем культивируйте клетки в течение ночи в инкубаторе с низким содержанием кислорода.

На следующий день замените среду на свежую дифференцировочную среду. Соберите клетки в желаемые моменты времени, чтобы проверить эффективность разрушения генов с помощью количественной ОТ-ПЦР. Наконец, чтобы собрать клетки, добавьте один миллилитр 0,05% трипсина на лунку и инкубируйте клетки.

Добавьте пять миллилитров среды MEF на лунку, чтобы нейтрализовать трипсин. Раскрутите клетки в 200 раз больше g в течение пяти минут и используйте клеточную гранулу для выделения РНК. С помощью этой методики хорошо видны морфологические изменения.

Клетки в первый день дифференцировки больше, чем клетки нулевого дня. По мере дифференцировки клетки делятся и расширяются от центра колонии, увеличиваясь в направлении наружу. Отдельные колонии сливаются вместе на пятый день дифференцировки, причем клетки растут друг на друге.

Анализ QRT-ПЦР показывает, что относительные уровни экспрессии плюрипотентного С-маркера NANOG снижаются на 75% после одного дня дифференцировки при культивировании клеток с BMP4 и снижаются на 90% в присутствии BMP4/A/P. Ко второму дню дифференцировки уровни NANOG очень низки для клеток, культивируемых только в BMP4 или в BMP4/A/P по сравнению с клетками в среде hESC CM, содержащей бета-FGF. Трансфекция, выполненная с использованием плазмиды GFP и введенная в клетки, обработанные BMP4/A/P, в первый и третий день дифференцировки показала эффективность трансфекции от 30 до 50% через 24 часа после трансфекции.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как дифференцировать плюрипотентные клетки человека в трофобластические клетки in vitro и как вводить конструкции ДНК для манипулирования экспрессией генов.