Развитие Метаргиз анизолия Как Mycoinsecticide: от изоляции до полевых характеристик

Ни одно разумное использование синтетических пестицидов не представляет постоянной угрозы для окружающей среды и здоровья человека. Биоконтроль с использованием бактерий, вирусов и грибков является подходящей альтернативой для борьбы с различными насекомыми-вредителями в сельском хозяйстве. В отличие от бактерий и вирусов, насекомых-возбудителей грибов, они эффективны при контакте.

Вид Metarhizium является одним из самых эффективных насекомых-патогенов грибов. Известно, что он атакует более 200 видов насекомых-вредителей. Мы разработали микоинсектицид с использованием спор аборигенных изолятов Metarhizium.

В этом видео вам будут показаны протоколы выделения и идентификации местных грибковых изолятов, биотестирование насекомых для скрининга и выбора более мощных штаммов, производство спор выбранных штаммов Metarhizium, а также протокол создания экономически эффективной формулы микоинсектицида для применения в полевых условиях. Также будут освещены меры контроля качества, которые должны быть предприняты во время коммерческого производства. Выделение энтомопатогенных грибов может быть осуществлено тремя методами.

Во-первых, из почв. Metarhizium является природным грибом в большинстве почв. Для получения большого разнообразия изолятов собираются почвы с полей с различными видами культур и из далеко отстоящих друг от друга регионов.

Образец почвы отбирается на глубине от четырех до шести дюймов под поверхностью. Образцы с места сбора собираются в промаркированные пакеты, а позже в лаборатории 10 граммов каждого образца перекладываются во флаконы. Метаризий выделяют методом разбавления почвы пластинчатым методом.

10 грамм образца почвы переносят на 90 мл стерильного 0,1%Tween 80. Кашицу перемешивают магнитной мешалкой в течение 60 минут. Между тем, 900 микролитров аликвот Tween 80 подготавливаются для дочернего разбавления.

Надосадочная жидкость из суспензии теперь последовательно разводится в Tween 80 аликвот. Сто микролитров аликвоты из каждого образца наносится на среду, описанную Келлером и другими. Пластины инкубируются при температуре 28 градусов в течение трех-семи дней.

Отдельные колонии спорулирующих особей позже субкультивируются в той же среде для получения чистых культур. Чтобы изолировать насекомое-патогенный грибок, с полей собирают мертвых насекомых. Споры из микозных трупов отделяют путем переноса их в Tween 80, а затем путем вортексирования.

Затем споровая суспензия наносится на агаровую пластину. Чистые культуры получают путем дальнейшей субкультурации на той же среде. Для приманки энтомопатогенных грибов из почвы используют личинок рисового солода.

Четыре личинки рисового солода добавляются во флакон, содержащий 60 грамм образца почвы. Флаконы инкубируются при температуре 28 градусов. Эти личинки обычно перемещаются глубоко в почву, поэтому флаконы переворачивают вверх дном каждый день на срок до 14 дней, чтобы облегчить контакт личинок со спорами грибов в почве.

Мертвых личинок время от времени вынимают и держат для спороношения в инкубаторе с влажностью. Процесс выделения грибка такой же, как и для трупов насекомых. После получения чистых культур изоляты выдерживают на наклонах PDA, а материнские культуры поддерживают при температуре восемь градусов по Цельсию до использования.

Для идентификации грибов из биомассы мицелия извлекают геномную ДНК. Для идентификации изолятов Metarhizium используются следующие праймеры: пять простых, три простых, ITS1 и ITS4. Ампликоны ожидаемого размера элюируются, количественно оцениваются и секвенируются.

Затем последовательности были проверены с помощью базы данных NCBI GenBank для идентификации изолятов на уровне видов. Образцы почвы и мертвых насекомых, собранные в районах Пуна и Булдана, штат Махараштра, Индия, дали 68 различных изолятов Metarhizium. Из них 58 были выделены из почвы и 10 — из насекомых.

55 из них были Metarhizium anisopliae, восемь — Metarhizium flavoviridae и пять — Metarhizium robertsii. Споры из косых добавляют в 10 мл Tween 80 и делают вортекс. Для биопроб на насекомых количество спор измеряется с помощью гемоцитометра.

И количество доводится до 10, повышается до семи спор на мл. Набор из 30 личинок в трех экземплярах погружают по отдельности в споровую суспензию объемом 10 мл каждого изолята Metarhizium на пять секунд. Личинки Helicoverpa armigera в конце второго или начале третьего возраста используются для биопроб насекомых.

После обработки каждую личинку перекладывают в стерильную мерзость, содержащую влажную ватман фильтр-бумагу номер один и кусочек обеззараженной бамии в качестве корма. В качестве контроля служит набор из 30 личинок в тройном составе, обработанных 0,1%Tween 80 в стерильной дистиллированной воде. Личинки хранятся до тех пор, пока они не умрут, и находятся под наблюдением до 14 дней.

Эти шаги были повторены для всех 68 изолятов. Процент смертности рассчитывается путем подсчета мертвых и живых личинок. Мертвых личинок переносят в стерильные чашки Петри, содержащие большую часть ватных палочек, и хранят при температуре 28 градусов по Цельсию и относительной влажности от 70 до 80% в течение трех-семи дней для выявления микоза и спороношения.

Данные о процентной смертности из трех экспериментов были собраны для получения средних значений, которые затем скорректированы с помощью формулы Эбботта. 12 изолятов Metarhizium, которые показали более 90% смертности, были отобраны для определения медианы летального времени против личинок Helicoverpa armigera третьего возраста. На основе значений LT 50 были идентифицированы пять изолятов, которые быстрее убивают насекомых.

Медианные летальные концентрации для идентифицированных пяти изолятов определяли с использованием четырех различных концентраций споровой суспензии. На основе значений LC 50 были выбраны три изолята Metarhizium для производства спор методом твердофазной ферментации. Среда YPD подготавливается и стерилизуется путем автоклавирования при температуре 121 градус Цельсия в течение 20 минут.

Споры из наклонов переносятся в 0,1%Tween 80. Споровые суспензии трех выбранных изолятов Metarhizium добавляют в среду YPD. Затем колбы инкубируются в шейкере.

Автоклавируемые пакеты с единорогами, наполненные двумя килограммами риса, замачивают на ночь в одном литре дистиллированной воды, а затем автоклавируют при температуре 121 градус по Цельсию в течение 45 минут. Твердофазная ферментация была протестирована на таких субстратах, как рис, сорго, кукуруза и пшеница. Среди протестированных субстратов рис показал максимальное спороношение изолятов Metarhizium.

Мешки инокулированы 48-часовой 10%-ной мицелиальной биомассой. Это хорошо перемешивается и выдерживается в течение 14 дней. Споры можно собирать разными методами.

Для изоляции с помощью Mycoharvester и Vibrosifter мешки, содержащие спорулированный мицелий, сушат при температуре 37 градусов по Цельсию в течение двух дней, чтобы снизить содержание влаги до менее чем 20%. Рис со спорами укладывают в большие сосуды. В сосуды вливают 0,1%Tween 80, и смесь хорошо перемешивают.

Надосадочная жидкость фильтруется, чтобы удалить любые частицы риса. Споры концентрируются и отделяются центрифугированием. Затем споры сушат при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух дней.

Эти споры можно хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию до использования. Чтобы увеличить срок годности при хранении, добавляют тальк и смешивают со спорами. Чтобы споры были эффективными, они должны быть жизнеспособными, поэтому необходимо определить изолят, который дает максимальное количество жизнеспособных спор.

Споровые суспензии получают в дозе 0,1%Tween 80 и доводят до 10, увеличивают до семи спор на мл. 10 мкл споровой суспензии распределяют на предметных стеклах PDA в трех экземплярах, а затем инкубируют. В течение 12 часов жизнеспособные споры начинают прорастать.

Через 12 часов споры, образующие зародышевую трубку, подсчитываются под микроскопом. Гидрофильность спор важна для того, чтобы гриб прилип к кутикуле насекомого. Споровую суспензию в сульфате аммония и Твин 80 берут в кюретку.

Другой, без спор, берется за контроль. Количество споровой суспензии доводят примерно до 7-10, повышая до семи спор на мл, чтобы получить начальную абсорбцию 0,6 на 540 нанометрах. Кюреткам дают постоять в неподвижном состоянии около шести часов для оседания спор

Регистрируется абсорбция и рассчитывается время, затраченное на 50% питание. На основании полученных результатов был выбран один штамм для применения в полевых условиях. Два других служили в качестве резервных штаммов.

Полевые исследования спор выбранного изолята Metarhizium M34412 для борьбы с заражением Helicoverpa armigera на посеве голубиного гороха проводили в рандомизированном блочном дизайне с четырьмя репликациями. Существует две разные формулы распыления. Состав в 0,1%Tween 80 распыляют с помощью ранцевого распылителя.

Масляная формула спор распыляется с помощью распылителя сверхмалого объема. Опрыскивание производится либо утром, либо вечером. Первое опрыскивание производится во время состояния цветения, и его повторяют еще два раза с интервалом в 14 дней.

Helicoverpa armigera собирают на нуле, три, пять, семь и 14 дней после опрыскивания и выдерживают в камере влажности для выявления микоза. В ходе полевых испытаний по борьбе с Helicoverpa armigera у голубиного гороха эффективность более 70% была получена при использовании Metarhizium anisopliae M34412. Было обнаружено, что повреждение стручков на участках, обработанных Metarhizium anisopliae, было наименьшим по сравнению с участками, обработанными химическим пестицидом, и необработанными контрольными участками.

Листья голубиного гороха исследуются на предмет каких-либо эффектов благодаря составу микоинсектицида на основе дизельного подсолнечного масла. На участках, обработанных Metarhizium anisopliae, были собраны членистоногие, обитающие в почве, и насекомые, обитающие в листе. Никакого вредного воздействия на нецелевых членистоногих не наблюдалось.

Демонстрационные испытания проводились в деревне doo-lally-pra-va-da, в которых приняли участие 20 фермеров. Препарат эффективен против других насекомых-вредителей, таких как жирная совка, пятнистый стручковый точильщик, мучнистый червец, шерстистая тля и комары. В ходе экспериментов удалось выявить важнейшие параметры контроля качества при производстве микоинсектицидов.

Жизнеспособность спор, измеренная как прорастание спор, должна составлять более 90% на ОАПК через 16 часов при температуре 28 градусов по Цельсию и относительной влажности от 70 до 80%. Смертность Helicoverpa armigera должна составлять более 90% с 10 до семи спор в лабораторном биоанализе. При многократном выращивании на искусственной лабораторной среде организм теряет свою вирулентность.

После культивирования гриба в хитиновой среде в течение 72 часов измеряют активность ферментов, разрушающих кутикулу, таких как хитиназа, хитиндеацетилаза, хитозаназа, протеаза и липаза. Они служат биохимическими маркерами вирулентности. Четыре различных набора из трех ферментов рестрикции были использованы для переваривания генов хитиназы.

Изоляты с смертностью более 90% показали специфическую картину для всех трех генов. Эти паттерны демонстрируют значительную корреляцию с профилями ферментов, разрушающих кутикулу, производимыми внеклеточно изолятами Metarhizium. Впервые мы предположили, что активность фермента хитиназы и ПЦР-паттерн гена хитиназы являются маркерами вирулентности.

Это может служить показателями качества для промышленного производства. Чтобы сделать продукт более экономичным, мы можем использовать биомассу мицелия для стимулирования корней ядра растения. Его также можно использовать для выделения хитозаназы в медицинских целях.

Эти продукты с добавленной стоимостью сделают этот микоинсектицид на основе Metarhizium более прибыльным.