Сотовый Lineage Анализы и функции генов исследований с использованием Twin-спот MARCM
2 марта 2017 г.
Здесь мы приводим протокол для мозаичной техники маркировки, которая позволяет визуализировать нейронов, полученных из общей клетки-предшественника в двух различных цветах. Это облегчает нейронную анализ клонов с возможностью рождения-знакомства отдельных нейронов и изучения функции гена в одних и тех же нейронов разных людей.
Общая цель этого протокола MARCM с двумя пятнами заключается в проведении анализа клеточных линий с высоким разрешением и улучшении исследований функций генов. Мозговая ткань состоит из огромного количества разнообразных нейронов, поэтому сложно изучить механизм, лежащий в основе того, как нейроны собираются вместе во время развития. Основное преимущество этого метода заключается в том, что нейроны, полученные от общих предшественников нейронов, могут быть помечены двумя различными цветами.
Которые позволяют извлекать информацию об образовании отдельных нейронов. Таким образом, этот метод может помочь исследователям изучить клеточный и молекулярный механизм, лежащий в основе развития нейронов. Демонстрировать процедуру сегодня будет Пей-Чи Чунг.
Техник из лаборатории профессора Юй. Начните с смешивания готовых самцов и самок MARCM с двойным пятном в флаконе с кормом для мух со свежими дрожжами во флаконе. Поддерживайте готовность скрещенных двухпятнистых мух MARCM при температуре 25 градусов Цельсия в течение двух дней, чтобы повысить вероятность спаривания перед сбором оплодотворенных яиц.
Чтобы избежать переполнения, когда личинки вылупятся, выложите готовые мухи MARCM с двойным пятном и переложите их в свежедрожжевые флаконы. Культивируйте двухпятнистое потомство MARCM, пока они не достигнут нужной стадии развития. Здесь мухи на стадии личинки подвергаются тепловому шоку, чтобы вызвать выражение лица.
Перенесите флаконы с мухами на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 10, 20, 30, 40 и 50 минут, чтобы определить оптимальный тепловой шок для выражения флиппаса. Для создания интересующих вас клонов MARCM с двойным пятном. Время теплового шока определяет стадию генерации расчистки, в то время как период теплового шока определяет, сколько вырубок будет создано.
Культивируйте животных с двойным пятном MARCM при температуре 25 градусов Цельсия, до желаемой стадии развития. Затем приступают к окрашиванию и монтажу. Добавьте PBS в защитные тарелки для щипцов.
А затем переложите животных MARCM с двойным пятном в посуду. Глядя в диссекционный микроскоп, с помощью щипцов препарируйте мозг животных с двойным пятном MARCM. Для начала удалите голову из тела мухи.
Затем аккуратно удалите кутикулу, не повреждая мозг. Далее аккуратно удалите трахеи, которые выглядят как волокна белого цвета. Перенесите мозги в стеклянную пятнистую пластину, содержащую 4% формальдегида и PBS.
И закрепить при комнатной температуре на 20 минут. Начните процедуру окрашивания с трех промывки мозгов мухи 1%-ным ПБТ. А затем стирка с 1%-ным ПБТ три раза.
С встряхиванием по 30 минут каждый раз. Инкубируйте мозг мухи со смесью первичных антител в течение ночи при четырех градусах Цельсия или в течение четырех часов при комнатной температуре. Промойте и промойте мозги мухи три раза каждый с 1% ПБТ, встряхивая, как и раньше.
Затем инкубируйте мозг мухи со смесью вторичных антител в течение четырех часов при комнатной температуре или в течение ночи при четырех градусах Цельсия. После промывки и промывки мозгов, как и раньше, закрепите мозги на микропредметном стекле с антигашающим реагентом. А затем поставьте покровное стекло, чтобы накрыть и защитить мозги мухи.
Запечатайте края микрозащитного стекла и микрослайда прозрачным лаком для ногтей. Наконец, получите флуоресцентные изображения клонов MARCM с двойным пятном из образцов с помощью выбранной системы конфокальной микроскопии. На этом рисунке показаны результаты работы клона MARCM с двойным пятном, нейронов антеродорсальной обонятельной проекции VL2p, полученных путем индукции флиппазы.
Опосредует митотическую рекомбинацию в нейробласт adPN на эмбриональной стадии. На этой первой диаграмме показана картина нейрогенеза. На этом изображении головного мозга, полученном с помощью конфокального микроскопа, VL2p adPN показаны зеленым цветом и связаны с многоклеточными нейробластными adPN пурпурного цвета.
На этом изображении показаны клетки в боковом роге. Здесь показана морфология нейронов антенной доли. На этом рисунке показаны данные для adPN DL1.
Как видно из приведенного примера, adPN DL1 появляются на более поздних этапах разработки, чем adPN VL2p. Индукция двухпятнистых клонов MARCM DC3 adPNs показывает, что этот тип нейронов появляется на более поздних этапах развития. На этом изображении показано, что событие MARCM в двойном пятне происходит в негативном нейроне GAL4 в линии adPN.
После освоения этот метод может помочь исследователям проанализировать нейронную линию и предоставить различные маркеры для отличия нейронов от клона нейробласта. Кроме того, MARCM с двойным пятном может производить гомозиготные мутантные клоны для изучения молекулярного механизма. На гетерозиготном генетическом фоне.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол twin-spot MARCM, разработанный для высокоразрешающего анализа клеточных линий и изучения функций генов в нейронах. Маркируя нейроны, происходящие от общих клеток-предшественников, двумя различными цветами, исследователи могут эффективно отслеживать развитие и определять время появления отдельных нейронов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биология развития
Теоретические основы
- Ткань мозга состоит из разнообразного набора нейронов.
- Понимание механизмов сборки нейронов в процессе развития представляет собой сложную задачу.
- Современные методы могут не обеспечивать достаточного разрешения для отслеживания клеточных линий.
- Данный протокол направлен на решение этих проблем.
Цель исследования
- Для проведения детального анализа клеточных линий.
- Для расширения исследований функций генов в нейронах.
- Для облегчения изучения клеточных и молекулярных механизмов развития нервной системы.
Используемые методы
- Протокол Twin-spot MARCM для маркировки нейронов.
- Использование различных цветовых маркеров для отслеживания клеточных линий.
- Методы визуализации высокого разрешения.
- Анализ развития нейронов и функции генов.
Основные результаты
- Успешное мечение нейронов из общих клеток-предшественников.
- Возможность получения данных о времени рождения отдельных нейронов.
- Углубленное понимание нейрональных линий и развития.
- Потенциальные возможности применения при изучении функции генов у разных особей.
Выводы
- Протокол MARCM с двойным пятном (twin-spot) является ценным инструментом для нейробиологических исследований.
- Он позволяет проводить детальный анализ нейрональных линий и функций генов.
- Данный метод может значительно углубить наше понимание развития нервной системы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Понимание нейрональных линий и функций генов в модельных организмах дает фундаментальные сведения для валидации мишеней при разработке нейротерапевтических средств. Метод twin-spot MARCM позволяет проводить высокоразрешающее картирование порядка рождения нейронов и фенотипический анализ генетически идентичных нейронов у разных особей, что способствует снижению механистических рисков на ранних этапах поиска. Этот подход повышает прогностическую достоверность, связывая механизмы развития с функциональными исходами в системах, релевантных для заболевания.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем отслеживания нейрональных линий от общих предшественников для оценки функции генов в определенных популяциях клеток.
- Практическая ценность: способствует биологическому снижению рисков за счет фенотипического анализа гомозиготных мутантных клонов на гетерозиготном фоне, что уменьшает неопределенность в понимании механизмов.
- Прогностическая ценность: помогает в приоритизации портфеля исследований, предоставляя количественные данные о клеточных линиях, которые коррелируют с механизмами нейроdevelopmentальных заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет создавать валидированные, цветово-дифференцированные нейронные системы, подходящие для последующего скрининга соединений в нейронных цепях, имеющих значение при заболеваниях.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет индуцибельной, стадие-специфичной генерации клонов, контролируемой продолжительностью теплового шока.
- Масштабируемость: позволяет повторно использовать платформу для различных подтипов нейронов (например, линий adPN) для сравнительного фенотипического скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: способствует моделированию систем, имеющих отношение к заболеваниям, обеспечивая возможность анализа очередности рождения нейронов, участвующих в развитии нейроонтогенетических расстройств.
- Снижение механистических рисков: позволяет проводить фенотипический анализ идентичных нейронов у разных животных, чтобы отличить генетическую вариабельность от стохастической при изучении функций генов.
- Доклиническая преемственность: связывает этапы поиска и валидации, предоставляя данные с разрешением по клеточным линиям для исследований взаимодействия с мишенями и модуляции сигнальных путей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод twin-spot MARCM интегрируется в общий процесс исследований — от ранней валидации мишеней до доклинических механистических исследований, особенно при изучении нейроонтогенетических нарушений, где критически важными являются происхождение и связность нейронов.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем связывания пертурбации генов с lineage-специфическими нейрональными фенотипами.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых нейрональных препаратов, готовых к анализу, с количественными показателями, основанными на времени рождения клонов и экспрессии маркеров.
- Аналитика: позволяет проводить сравнительный анализ морфологии нейронов и экспрессии генов на разных стадиях развития с использованием двухцветного считывания.
- Трансляционные исследования: обеспечивают связь с доклинической валидацией путем предоставления моделей, согласованных по линиям развития, для модуляции мишеней в соответствии с биомаркерами.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократно используемый инструмент для создания стандартизированных когорт нейронов в различных проектах и модельных системах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения влияния факторов, связанных с происхождением клеточных линий, в исследованиях функций генов.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию за счет контролируемой клональной индукции и стандартизированных протоколов окрашивания и монтажа препаратов.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет раннего выявления фенотипических эффектов, специфичных для конкретной линии, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Поддерживает движение по проекту с учетом рисков, обеспечивая механистическую ясность в отношении нейронных мишеней в гетерогенных тканях.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области генетики Drosophila, методов клонального маркирования и конфокальной микроскопии для точной интерпретации линий развития.
- Зависимость от оборудования, включая аппараты для теплового шока, диссекционные микроскопы и системы конфокальной визуализации для индукции и визуализации клонов.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами времени теплового шока, протоколов окрашивания и параметров визуализации для обеспечения согласованности клонов у разных пользователей.
- Требуется учитывать особенности адаптации при применении метода к различным нейронным линиям или стадиям развития, помимо представленной модели adPN.
- Включает практические ограничения, такие как зависимость эффективности клонирования от продолжительности теплового шока и необходимость оптимизации для каждой целевой линии, как указано в протоколе.
