Выделение и Обогащение печени подмножествах идентифицированных-предшественников маркером Комбинация Novel поверхности

Общие цели данного протокола переваривания печени заключаются в оценке различных подмножеств предшественников печени с помощью проточной цитометрии и выделении этих клеток с высокой степенью чистоты с использованием нового коктейля поверхностных маркеров для последующего анализа. Этот метод может помочь ответить на различные вопросы о биологии клеток-предшественников печени, например, каковы специфические особенности их подмножеств и каковы отдаленные причины их появления при повреждении печени. Основным преимуществом данной методики является возможность выделения клеток-предшественников с высокой чистотой и жизнеспособностью, что крайне важно для анализа in vitro.

Хотя данный метод дигестии позволяет изучить биологию клеток-предшественников, он также может быть использован для выделения популяций гемопоэтических и эндотелиальных клеток. Чтобы подготовить суспензию единичных клеток из печени мыши, перенесите доли печени в сухую чашку Петри и с помощью скальпеля разрежьте ткани на однородные кубики размером примерно 2 мм³.

Поместите образцы в водяную баню при 37 °C с осторожным перемешиванием на 5 и 10 минут. После 15 минут переваривания используйте пипетку на 1 000 µL с обрезанным наконечником, чтобы аккуратно тритурировать кусочки печени. Затем верните пробирки в баню и дайте кусочкам осесть в течение двух минут.

Затем профильтруйте две аликвоты супернатанта объемом примерно 700 µL через сито с размером пор 100 мкм, предварительно смоченное 800 µL буфера для сбора. Замените удаленный супернатант свежим буфером для переваривания. Когда ткани печени больше не будет видно, пропустите весь супернатант из пробирок для переваривания через фильтр.

Затем соберите все клетки путем центрифугирования. Ресуспендируйте осадки в 1 мл лизирующего буфера с хлоридом аммония и калием при комнатной температуре, остановив лизис через одну минуту добавлением 5 мл свежего буфера для сбора. Соберите клетки путем повторного центрифугирования.

Затем осторожно аспирируйте супернатант, чтобы не потревожить рыхлый осадок. Ресуспендируйте клетки в 4 мл свежего буфера для сбора на льду. Для определения количества клеток в образце печени методом проточной цитометрии сначала смешайте 20 µL суспензии клеток печени с 174 µL PBS в полистирольной пробирке объемом 1,5 мл и добавьте 6 µL пропидий-иодида.

Добавьте считающие бусины для количественного определения клеток и загрузите смесь бусин и клеток в проточный цитометр. Выполните гейтирование по параметрам бокового и прямого светорассеяния, чтобы исключить клеточный детрит. Исключите дублеты с помощью гейта по высоте и площади прямого светорассеяния, а также мертвые клетки, положительные по пропидиййодиду.

Затем внесите образец объемом 30 µL в проточный цитометр и зарегистрируйте события. Для окрашивания клеток печени с целью анализа популяций клеток-предшественников методом проточной цитометрии перенесите аликвоты по 2x10^5 клеток в реакционные пробирки объемом 1,5 мл. Осадите клетки путем центрифугирования.

Ресуспендируйте осадки в Fc-блокаторе и инкубируйте в течение пяти минут на льду. Затем добавьте по 50 мкл соответствующего коктейля антител для окрашивания клеточной поверхности в нужные пробирки и инкубируйте в течение 20 минут на льду в защищенном от света месте. По окончании инкубации промойте образцы, используя по 400 мкл буфера для окрашивания на каждый образец.

Затем ресуспендируйте осадки в 100 µL соответствующего коктейля вторичных антител и выдержите 20 минут на льду в защищенном от света месте. После этого промойте клетки еще 400 µL буфера для окрашивания. Ресуспендируйте осадки в 300 µL буфера для окрашивания, содержащего пропидийиодид.

Проанализируйте образец с помощью проточного цитометра. Для обогащения популяции клеток-предшественников методом сепарации с помощью магнитных микросфер перенесите 1,5-2x10^6 клеток в соответствующее количество конических пробирок объемом 15 мл и осадите клетки центрифугированием. Ресуспендируйте осадок в 400 µL раствора HBSS с добавлением BSA.

Добавьте 40 µL микросфер anti-CD31 и 30 µL микросфер anti-CD45, затем инкубируйте в течение 15 минут при температуре 4 °C. Далее промойте клетки в 5 мл HBSS с BSA. Ресуспендируйте осадок в 100 µL бус для удаления мертвых клеток и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.

Пока клетки инкубируются, уравновесьте одну колонку для положительной селекции подходящего размера на каждую печень, используя 3 мл HBSS с BSA. Затем добавьте к клеткам 900 µL HBSS с BSA и профильтруйте их через полиамидную фильтрующую сетку с размером пор 100 мкм. Загрузите профильтрованные клетки, инкубированные с микросферами, в колонки, собирая элюат в центрифужную пробирку.

После того как все клетки пройдут через колонку, трижды промойте колонки тремя миллилитрами HBSS с добавлением BSA. Осадите клетки путем центрифугирования и ресуспендируйте клеточный осадок в 100 µL промывающего буфера и Fc-блока. Используйте клеточные осадки от четырех-шести печеней или до количества менее 1x10^6 клеток, прошедших отрицательную селекцию.

Через пять минут проведите маркировку клеток биотинилированными антителами к GP38 в течение 10 минут на льду. По окончании инкубации соберите клетки путем центрифугирования для последующего ресуспендирования в 400 µL промывочного буфера и 5 µL микросфер Anti-Biotin. После 15 минут выдержки при 4 °C немедленно промойте клетки в 5 мл промывочного буфера.

Затем ресуспендируйте осадок в 1 мл свежего промывочного буфера. Поместите ресуспендированные клетки в охлажденный штатив на 15 пробирок и запустите автоматическое магнитное разделение. После этого центрифугируйте супернатант и ресуспендируйте осадки в соответствующем растворе для запланированного последующего экспериментального анализа.

Гейтирование по клеткам, негативным по CD45, CD31 и рецептору асиалогликопротеина 1, позволяет выделить клетки-предшественники печени, которые затем можно сгруппировать в зависимости от экспрессии гликопротеина 38 и CD133. Клетки gp38-положительные CD133-положительные и gp38-отрицательные CD133-положительные представляют собой наиболее многочисленные популяции среди CD45-отрицательных, CD31-отрицательных и ASGPR1-отрицательных клеток в печени здоровой взрослой мыши с явными различиями в экспрессии различных поверхностных маркеров, ранее ассоциированных с клетками-предшественниками. Изоляция этих клеток-предшественников с помощью магнитных микросфер, продемонстрированная выше, обеспечивает чистоту клеток печени более 90% при высокой степени их жизнеспособности.

При попытке изолировать эти редкие клетки важно учитывать ферменты, используемые на этапах переваривания печени, так как различные ферменты могут приводить к преимущественному получению определенных субпопуляций клеток-предшественников и значительно снижать уровни экспрессии CD133. Важно помнить, что чистота и выход клеток зависят от бережной подготовки суспензий одиночных клеток печени. Кроме того, большое количество клеточного дебриса и загрязнение погибающими клетками могут отрицательно повлиять на успех данного протокола.