Полидиметилсилоксан-поликарбонатные микрожидком Устройства для миграции клеток исследований при Перпендикулярного химической и кислорода Градиентов

Общая цель этого эксперимента заключается в создании микрофлюидного устройства из полидиметилсилоксан-поликарбоната для миграции клеток млекопитающих при различных комбинациях перпендикулярных химических и кислородных градиентов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в исследованиях миграции клеток млекопитающих, в том числе о влиянии этих градиентов на миграцию различных типов клеток или клеток с генами OTE. Основное преимущество этого метода заключается в том, что вся экспериментальная установка может быть проведена в обычном инкубаторе для достижения оптимальных условий культивирования клеток без утомительной настройки и громоздких инструментов.

Применение этого метода распространяется на диагностику способности раковых клеток к метастазированию, поскольку подвижность клеток и различные физиологически связанные градиенты могут быть охарактеризованы с помощью микрофлюидного устройства. Этот метод может дать представление о миграции клеток млекопитающих. Он также может быть применен к другим клеточным исследованиям, таким как тестирование in vitro клеточных лекарств на комбинации концентраций лекарств и напряжения кислорода.

Перенесите два грамма полидиметилсилоксана или предварительного полимера PDMS на форму с верхним слоем жидкостных каналов, чтобы получить тонкий слой PDMS. Затем поместите форму в эксикатор для дегазации PDMS в течение 60 минут. После дегазации поместите форму на ночь в духовку при температуре 60 градусов Цельсия для отверждения PDMS.

Убедитесь, что форма находится в горизонтальной плоскости. После охлаждения формы до комнатной температуры залейте в форму еще 13 граммов предварительного полимера PDMS, затем дегазируйте PDMS в установке эксикатора в течение 60 минут. Медленно встраивает поликарбонат толщиной в один миллиметр или пленку PC в свежий слой PDMS в качестве газодиффузионного барьера.

Удалите все присутствующие пузырьки. Затем поместите форму в духовку при температуре 60 градусов Цельсия на ночь. Следите за тем, чтобы форма находилась в горизонтальной плоскости.

Охладив отвержденный PDMS до комнатной температуры, разрежьте устройство скальпелем на площадь примерно 5,5 на пять квадратных сантиметров, которая может покрыть все узоры каналов. Затем измельчите лабораторию PDMS из формы. Затем проделайте отверстия для входных и выходных отверстий с помощью биопсийного перфоратора диаметром два миллиметра.

Храните изготовленный верхний слой PDMS-PC вдали от окружающей пыли для последующей сборки. Для сборки устройства сначала поместите изготовленный верхний слой PDMS-PC и пластину с мембраной PDMS со спин-кодом в машину для кислородно-плазменной обработки поверхности связующими поверхностями вверх. Обрабатывайте поверхности PDMS кислородной плазмой мощностью 90 Вт в течение 40 секунд.

Приклейте верхний слой к мембране PDMS сразу после обработки поверхности кислородной плазмой. Положите груз поверх склеенных слоев и поставьте их в духовку при температуре 60 градусов Цельсия на ночь, чтобы способствовать склеиванию. После того, как склеенные слои остынут до комнатной температуры, разрежьте скальпелем скрепленную к верхнему слою мембрану на площади примерно 5,5 на пять квадратных сантиметров.

Отшлифуйте связующую структуру от силиконовой пластины и пробейте отверстия на входах и выходах химического градиентного канала с помощью биопсийного пуансона диаметром два миллиметра. Затем поместите верхний слой со склеиванием мембраны и изготовленный нижний слой PDMS в машину для обработки поверхности кислородной плазмой контактирующими поверхностями вверх. Чтобы активировать поверхности PDMS, используйте плазму мощностью 90 Вт в течение 40 секунд.

Соедините верхний и нижний слои вместе для склеивания сразу после обработки поверхности. Поместите груз поверх всего склеенного устройства и оставьте его на ночь в духовке при температуре 60 градусов Цельсия. На следующий день достаньте все изготовленное устройство из духовки и охладите его до комнатной температуры.

Начните анализ миграции микрофлюидных клеток с подготовки клеток в устройстве, как описано в текстовом протоколе. На второй день аспирируйте среду из клеток, которые были культивированы с нулевого дня, и промойте клетки пятью миллилитрами DPBS два раза. Аспирируйте DPBS и добавьте два миллилитра Trypsin-EDTA, затем инкубируйте клетки в инкубаторе в течение пяти минут, чтобы отделить клетки от поверхности колбы.

После того, как клетки будут отделены и суспензированы в растворе, добавьте в колбу восемь миллилитров среды, не содержащей сыворотки. Перелейте все жидкости в 15-миллилитровую коническую пробирку и центрифугируйте ее при 140-кратном G в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте соответствующее количество бессывороточной среды для достижения конечной плотности клеток в один миллион клеток на миллилитр.

Затем извлеките микрофлюидное устройство, подготовленное в первый день, как описано в текстовом протоколе. С помощью одномиллилитрового шприца с тупой иглой 14-го калибра введите бессывороточную среду через выходное отверстие химического градиентного канала до тех пор, пока среда не вытечет из обеих игл на входе. Затем введите 200 микролитров клеточной суспензии из выходного отверстия химического градиентного канала.

Понаблюдайте за камерой для культивирования клеток в устройстве под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки были введены в микрофлюидный канал. Затем поместите устройство во влажный контейнер и держите его в инкубаторе для клеточных культур в течение пяти часов, чтобы способствовать адгезии клеток к поверхности устройства. Тем временем приготовьте химическое вещество в нужной концентрации в среде, не содержащей сыворотки.

Наберите бессывороточную среду с химическим веществом и без него в два отдельных трехмиллилитровых шприца, соединенных с трубкой высокой чистоты. Затем установите шприцы на шприцевой насос со скоростью потока один микролитр в минуту для последующего использования. Далее вносят 15 миллилитров одномолярного раствора гидроксида натрия и 15 миллилитров 200 миллиграмм на миллилитр раствора пирогаллола.

Наберите раствор гидроксида натрия в шприц объемом 15 миллилитров, подключенный к трубке PFTE высокой чистоты, и наберите раствор пирогаллола в шприц объемом 15 миллилитров, подключенный к трубке высокой чистоты. Установите шприцы на шприцевой насос с расходом пять микролитров в минуту для последующего использования. После пятичасовой инкубации выньте все устройство и поместите его на чашку Петри диаметром 15 сантиметров.

Закрепите устройство в чашке Петри с помощью клеевой замазки, затем перенесите чашку Петри в микроскоп для визуализации живых клеток в инкубаторе. Подсоедините трубки от шприцев к входным отверстиям канала химического градиента для генерации химического градиента. Затем подсоедините выпускное отверстие к трубке, ведущей к резервуару для отходов.

Включите шприцевой насос со шприцами для генерации химического градиента. Далее подсоедините высокочистые трубки от шприцев, содержащих хлорид натрия и пирогаллол, к входным отверстиям кислородного градиентного канала. Подсоедините трубку к выходному отверстию для сбора отходов и включите шприцевой насос со шприцами для генерации градиента кислорода.

Добавьте в чашку Петри около 15 миллилитров дважды дистиллированной воды, чтобы прибор оставался увлажненным. Затем настройте микроскоп для визуализации живых клеток для покадровой съемки и делайте снимок каждые 15 минут. Выполнение сбора и анализа данных, а также определения характеристик градиентов, как описано в текстовом протоколе.

Здесь представлены репрезентативные результаты химических градиентов, генерируемых в микрофлюидном устройстве для миграции клеток. Результат численного моделирования хорошо согласуется с экспериментальной характеристикой с использованием раствора флуоресцеина в качестве химического вещества. Градиенты других химических веществ, таких как хемокин SDF-1 альфа, также могут быть оценены заранее с помощью моделирования.

Градиенты кислорода, генерируемые в устройстве, могут быть экспериментально охарактеризованы с помощью кислород-чувствительного флуоресцентного красителя. Как правило, градиенты кислорода от 1% на входе до 16% на выходе могут стабильно устанавливаться внутри устройства. Здесь представлены типичные покадровые изображения, собранные во время экспериментов с помощью микроскопа для визуализации живых клеток.

После анализа изображений можно рассчитать траектории миграции клеток A549 и их средние перемещения. При отсутствии градиентов клетки демонстрируют случайную миграцию, а среднее движение близко к нулю. Имея только альфа-хемокиновый градиент SDF-1, клетки демонстрируют хемотаксическое поведение и мигрируют в направлении высокого хемокинового градиента, как и ожидалось.

Имея только градиент кислорода, клетки движутся в направлении с низким содержанием кислорода, демонстрируя аэротаксическое поведение, которое не было хорошо изучено для клеток млекопитающих. Интересно, что как с хемокиным, так и с кислородным градиентами клетки движутся к градиенту с низким содержанием кислорода, показывая, что кислородный градиент имеет доминирующие эффекты. Это наблюдение требует дальнейшего изучения.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости хорошо выровнять устройство во время изготовления и устранить пузырьки воздуха в микрофлюидном устройстве во время эксперимента по миграции клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить микрофлюидное устройство PDMS-PC и настроить эксперименты по изучению миграции клеток млекопитающих при комбинации химических и кислородных градиентов.