Полидиметилсилоксан-поликарбонатные микрожидком Устройства для миграции клеток исследований при Перпендикулярного химической и кислорода Градиентов

Общая цель данного эксперимента — создание микрофлюидного устройства на основе полидиметилсилоксана и поликарбоната для изучения миграции клеток млекопитающих в условиях различных комбинаций перпендикулярных химических и кислородных градиентов. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в исследованиях миграции клеток млекопитающих, включая влияние этих градиентов на миграцию различных типов клеток или клеток с измененными генами. Основным преимуществом данной методики является то, что вся экспериментальная установка может находиться в обычном инкубаторе для обеспечения оптимальных условий культивирования клеток без необходимости в трудоемкой подготовке и использовании громоздкого оборудования.

Возможности применения данной методики распространяются на диагностику способности раковых клеток к метастазированию, поскольку с помощью микрофлюидного устройства можно охарактеризовать подвижность клеток и различные физиологически значимые градиенты. Этот метод позволяет получить представление о миграции клеток млекопитающих. Он также может быть использован в других исследованиях клеток, например, при тестировании лекарственных препаратов на клеточных моделях in vitro с использованием различных комбинаций концентраций препаратов и уровней парциального давления кислорода.

Перенесите два грамма полидиметилсилоксана (ПДМС-преполимера) на форму с шаблонами микрофлюидных каналов верхнего слоя, чтобы создать тонкий слой ПДМС. Затем поместите форму в эксикатор для дегазации ПДМС в течение 60 минут. После дегазации поместите форму в печь при температуре 60 °C на ночь для отверждения ПДМС.

Убедитесь, что форма находится в горизонтальной плоскости. После охлаждения формы до комнатной температуры налейте на нее дополнительные 13 грамм преполимера PDMS, затем удалите пузырьки воздуха из PDMS в эксикаторе в течение 60 минут. Медленно введите поликарбонатную пленку (PC) толщиной 1 мм в свежий слой PDMS в качестве газодиффузионного барьера.

Удалите все имеющиеся пузырьки воздуха. Затем поместите форму в печь при температуре 60 °C на ночь. Убедитесь, что форма находится в горизонтальном положении.

После охлаждения отвержденного PDMS до комнатной температуры вырежьте скальпелем область устройства размером примерно 5,5 на 5 квадратных сантиметров, чтобы она охватывала все структуры каналов. Затем отделите слой PDMS от формы. После этого с помощью биопсийного панча диаметром 2 мм проколите отверстия для входов и выходов.

Храните изготовленный верхний слой ПДМС-ПК в защищенном от пыли месте до момента сборки. Для сборки устройства сначала поместите изготовленный верхний слой ПДМС-ПК и пластину с нанесенной методом центрифугирования ПДМС-мембраной в установку для обработки поверхности кислородной плазмой сторонами, подлежащими склеиванию, вверх. Обработайте поверхности ПДМС кислородной плазмой мощностью 90 Вт в течение 40 секунд.

Присоедините верхний слой к мембране из PDMS сразу после обработки поверхности кислородной плазмой. Поместите груз на верхнюю часть соединенных слоев и оставьте их в печи при температуре 60 °C на ночь для обеспечения надежного склеивания. После того как соединенные слои охлалились до комнатной температуры, вырежьте скальпелем мембрану, прикрепленную к верхнему слою, до размера примерно 5,5 на 5 квадратных сантиметров.

Отделите склеенную структуру от кремниевой пластины и проколите отверстия во входах и выходах канала химического градиента с помощью биопсийного панча диаметром 2 мм. Затем поместите верхний слой с прикрепленной мембраной и изготовленный нижний слой из PDMS в установку для обработки поверхности кислородной плазмой поверхностями для склеивания вверх. Для активации поверхностей PDMS используйте плазму мощностью 90 Вт в течение 40 секунд.

Сразу после обработки поверхности соедините верхний и нижний слои для склеивания. Поместите груз на всю склеенную конструкцию и оставьте ее на ночь в духовке при температуре 60 °C. На следующий день извлеките все изготовленное устройство из духовки и охладите его до комнатной температуры.

Начните анализ миграции клеток в микрофлюидном устройстве с подготовки клеток в устройстве, как описано в текстовом протоколе. На второй день удалите среду из клеток, которые культивировались с нулевого дня, и дважды промойте клетки пятью миллилитрами DPBS. Удалите DPBS и добавьте два миллилитра Trypsin-EDTA, затем поместите клетки в инкубатор на пять минут, чтобы отделить их от поверхности флакона.

После того как клетки отделятся и окажутся во взвешенном состоянии в растворе, добавьте в колбу восемь миллилитров безсывороточной среды. Перенесите всю жидкость в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте ее при 140 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования аспирируйте супернатант и добавьте необходимое количество безсывороточной среды, чтобы конечная плотность клеток составила один миллион клеток на мл.

Затем извлеките микрофлюидное устройство, подготовленное в первый день согласно текстовому протоколу. Используйте шприц объемом 1 мл с тупоконечной иглой 14G, чтобы ввести безсывороточную среду через выход химического градиентного канала до тех пор, пока среда не начнет вытекать из обеих игл на входах. Затем введите 200 µl клеточной суспензии через выход химического градиентного канала.

Осмотрите камеру для культивирования клеток в устройстве под микроскопом, чтобы подтвердить введение клеток в микрофлюидный канал. Затем поместите устройство во влажный контейнер и выдержите его в инкубаторе для культур клеток в течение пяти часов для обеспечения адгезии клеток к поверхности устройства. Тем временем подготовьте химическое вещество в требуемой концентрации в безсывороточной среде.

Наберите безсывороточную среду с добавлением химического вещества и без него в два отдельных шприца объемом 3 мл, подключенных к трубкам высокой степени очистки. Затем установите шприцы на шприцевой насос со скоростью потока 1 µL/min для последующего использования. Далее приготовьте 15 мл 1 M раствора гидроксида натрия и 15 мл раствора пирогаллола в концентрации 200 mg/mL.

Наберите раствор гидроксида натрия в шприц объемом 15 мл, соединенный с трубкой из высокочистого ПТФЭ, и наберите раствор пирогаллола в шприц объемом 15 мл, соединенный с высокочистой трубкой. Установите шприцы в шприцевой насос со скоростью потока 5 µL/мин для последующего использования. После пятичасовой инкубации извлеките все устройство и поместите его в чашку Петри диаметром 15 см.

Закрепите устройство в чашке Петри с помощью адгезивного пластилина, затем перенесите чашку Петри в инкубатор с микроскопом для визуализации живых клеток. Подключите трубки от шприцев к входам канала химического градиента для создания химического градиента. Затем подключите выход к трубке, ведущей в резервуар для отходов.

Включите шприцевой насос со шприцами для создания химического градиента. Затем подсоедините трубки высокой чистоты от шприцев, содержащих хлорид натрия и пирогаллол, к входным отверстиям канала градиента кислорода. Подсоедините трубку к выходному отверстию для сбора отходов и включите шприцевой насос со шприцами для создания градиента кислорода.

Добавьте в чашку Петри около 15 миллилитров дважды дистиллированной воды для поддержания увлажненности устройства. Затем настройте микроскоп для визуализации живых клеток для захвата изображений в режиме таймлапса и делайте снимок каждые 15 минут. Выполните сбор и анализ данных, а также характеристику градиентов в соответствии с текстовым протоколом.

Здесь представлены репрезентативные результаты создания химических градиентов внутри микрофлюидного устройства для миграции клеток. Результат численного моделирования хорошо согласуется с экспериментальной характеристикой, в которой в качестве химического вещества использовался раствор флуоресцеина. Градиенты других веществ, таких как хемокин SDF-1 alpha, также могут быть предварительно оценены с помощью моделирования.

Градиенты кислорода, создаваемые внутри устройства, могут быть экспериментально охарактеризованы с использованием кислород-чувствительного флуоресцентного красителя. Как правило, в устройстве могут быть стабильно установлены градиенты кислорода от 1% в верхней части до 16% в нижней части. Здесь представлены типичные изображения с временным интервалом, полученные в ходе экспериментов с помощью микроскопа для визуализации живых клеток.

После анализа изображений можно рассчитать траектории миграции клеток A549 и их среднее перемещение. В отсутствие градиентов клетки демонстрируют случайную миграцию, и среднее перемещение близко к нулю. При наличии только градиента хемокина SDF-1 alpha клетки проявляют хемотаксическое поведение и, как и ожидалось, мигрируют в направлении высокого градиента хемокина.

При наличии только градиента кислорода клетки перемещаются в сторону пониженного содержания кислорода, демонстрируя аэротаксический ответ, который ранее недостаточно изучался для клеток млекопитающих. Интересно, что при одновременном воздействии градиентов хемокина и кислорода клетки движутся по градиенту пониженного содержания кислорода, что указывает на доминирующее влияние градиента кислорода. Данное наблюдение требует дальнейшего изучения.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости тщательного выравнивания устройства во время изготовления, а также об удалении пузырьков воздуха в системе микрофлюидного устройства при проведении эксперимента по миграции клеток. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготовить микрофлюидное устройство PDMS-PC и организовать эксперименты по изучению миграции клеток млекопитающих в условиях комбинированных химических и кислородных градиентов.