Мембранный потенциал монокристалла монокристалла в живых эмбрионах данио

Общая цель данной процедуры заключается в изучении электрических свойств возбудимых клеток в неинвазивных физиологических условиях с использованием эмбрионов zebrafish и GEVI на основе FRET. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы, касающиеся биологии возбудимых клеток, таких как нейроны. Например, данный метод может быть использован для анализа роли возбудимости в патогенезе неврологических расстройств.

Данный подход предполагает использование прозрачных эмбрионов zebrafish, экспрессирующих генетически кодируемые вольтаж-индикаторы на основе FRET. Этот метод позволяет неинвазивно измерять электрические свойства клеток in vivo, что дает возможность изучить возбудимость спинальных нейронов в эмбрионах zebrafish.

Данный метод также может быть применен к другим системам in-vitro или in-vivo, подходящим для проведения визуализационных исследований. Для начала процедуры приготовьте ПЦР-смесь для амплификации кодирующей последовательности биосенсора Mermaid. Нагрейте ПЦР-смесь в течение 15 секунд при 95 °C.

Проводите праймирование в течение 15 секунд при 50 °C и элонгацию в течение четырех минут при 72 °C в общей сложности 35 циклов. После этого выделите специфический тупой ПЦР-продукт с помощью коммерческого набора для очистки из геля. Затем клонируйте фрагмент ДНК в тупой вектор pCMV-SC и линеаризуйте плазмиду, положительную по Mermaid, с помощью рестриктазы SmaI для вставки промотора HuC.

Проведите реакцию рестрикции в общем объеме 20 µL и инкубируйте смесь при температуре 25 °C в течение одного часа. Затем очистите рестригированную плазмиду с помощью коммерческого набора для очистки из геля. После этого проведите ПЦР-амплификацию промотора HuC, используя ДНК-полимеразу PFU и геномную ДНК данио-рерио в качестве матрицы.

Приготовьте ПЦР-смесь. После начального этапа при 95 °C в течение двух минут подвергните ПЦР-смесь нагреву при 95 °C в течение 15 секунд. Проведите отжиг праймеров при 50 °C в течение 15 секунд и элонгацию при 72 °C в течение четырех минут; повторите данный цикл 35 раз.

Затем проведите гель-очистку специфического тупоконцевого ПЦР-продукта. Проведите лигирование эквимолярных количеств очищенных ДНК pCMV-SC Mermaid и pHuC, используя 1 µL T4 DNA ligase и 1 µL Specific 10x buffer в общем объеме 10 µL. После этого инкубируйте реакционную смесь в течение 16 часов при температуре 4 °C.

Трансформируйте аликвоту компетентных клеток пятью микролитрами смеси для лигирования. Отоберите pHuC-положительные клоны с промотором, вставленным в правильной ориентации, с помощью двойного переваривания рестриктазами CEL1 и EcoRV. Перенесите клоны в пробирки объемом 15 мл и инкубируйте их при 37 °C в течение ночи.

После этого выделите плазмиду из клеток, проведите двойную реакцию рестрикции с использованием CEL1-EcoRV и инкубируйте смесь при 37 °C в течение одного часа. Затем нанесите продукты реакций на агарозный гель. В данной процедуре перенесите оплодотворенные икринки, полученные от взрослых особей zebrafish дикого типа или линии sod1G93R, в чашку Петри диаметром 10 мм.

Промойте эмбрионы в холодной рыбной воде. Затем немедленно проведите микроинъекцию в желток 200 пг плазмиды pHuC-Mermaid. После этого перенесите эмбрионы в чашку Петри и инкубируйте их в рыбной воде при температуре 28 °C до достижения стадии развития, необходимой для последующих анализов.

Для анализа спонтанного скручивания хвоста перенесите эмбрионы в круглую чашку Петри диаметром 90 мм, наполненную рыбой водой с содержанием 0,2% DMSO. Проведите ручное дехорионирование, используя два ювелирных пинцета с острыми концами или иглы. После этого инкубируйте эмбрионы в течение пяти минут при температуре 28 °C.

С помощью цифровой камеры, установленной на стереомикроскопе, зафиксируйте сворачивание хвоста при комнатной температуре в ходе одноминутной видеозаписи. Затем получите временную серию с временным разрешением 30 кадров в секунду. После этого рассчитайте частоту спонтанных сворачиваний хвоста, подсчитав количество изгибов за единицу времени.

Для оценки воздействия препарата рилузол перенесите эмбрионы в новую чашку Петри диаметром 90 мм, наполненную рыбной водой, содержащей 5 µM рилузола. Затем инкубируйте эмбрионы в течение пяти минут при 28 °C, после чего запишите минутное видео и проведите поведенческий анализ. Теперь зафиксируйте эмбрионы в возрасте 20–24 hpf в 1% низкоплавящем агарозе в рыбной воде в стеклянной чашке для визуализации диаметром 35 мм при 37 °C.

Поверните эмбрионы на бок и подождите, пока агароза затвердеет при комнатной температуре. Затем перенесите чашку для визуализации на предметный столик конфокального микроскопа. Определите мотонейроны, экспрессирующие биосенсор, возбуждая мономерный Umikinoko-Green аргоновым лазером с длиной волны 488 nanometer.

Затем установите диапазон эмиссии от 495 до 525 нанометров и нажмите кнопку записи. Для измерения FRET возбудите mUKG, донора FRET-пары, лазером с длиной волны 488 нанометров. Одновременно с помощью двух фотоумножителей регистрируйте флуоресценцию, испускаемую донором, и флуоресценцию, испускаемую мономерным акцептором Kusibira-Orange.

В начале эксперимента оптимизируйте коэффициент усиления (gain) и смещение (offset) первого фотоумножителя, который регистрирует флуоресценцию mUKG, и поддерживайте их неизменными на протяжении всей сессии. Чтобы установить смещение, измените цвет изображения на значения интенсивности, используя таблицу поиска Q. При сканировании с выключенным лазером используйте ползунок смещения так, чтобы интенсивность фоновых пикселей была чуть выше нуля.

Используя ту же таблицу поиска, включите лазер. Во время сканирования используйте ползунок усиления для максимизации отношения сигнал/шум, стараясь избегать появления насыщенных пикселей. В окне сбора данных программного обеспечения выберите режим сбора xyt и размер поля изображения 512 на 64 пикселя из выпадающего меню.

Затем настройте запись изменений напряжения в спинальных нейронах эмбриона так, чтобы один XY-плоскостной кадр регистрировался каждые 30 миллисекунд в течение одной минуты. Чтобы оценить влияние введения рилузола на деполяризацию мембраны того же нейрона, получите новый набор данных через пять минут после добавления рыбной воды, содержащей 5 µM рилузола. В данном видео были записаны спонтанные скручивания — моторные реакции, заключающиеся исключительно в сокращении всего тела, при котором кончик хвоста приближается к голове, на стадии от 20 до 24 hpf в обычной среде для рыб.

В данном видео демонстрируются спонтанные скручивания эмбриона после инкубации в 5 µM рилузола. Чтобы проверить, лежат ли в основе индуцированных рилузолом изменений частоты спонтанных скручиваний нарушения электрической активности спинальных мотонейронов, мембранный потенциал в спинальных мотонейронах эмбриона изучали полностью неинвазивным способом, измеряя отношение интенсивности флуоресценции донорно-акцепторной FRET-пары биосенсора Mermaid. Были идентифицированы первичные спинальные мотонейроны, экспрессирующие биосенсор, и зарегистрирована их базальная спонтанная деполяризационная активность.

Наряду со снижением частоты движений по скручиванию хвоста, введение рилузола привело к снижению частоты событий спонтанной деполяризации. После освоения данный подход позволит исследователям изучать электрические свойства нейронных сетей интактных эмбрионов, что полностью сохраняет сложность взаимодействий между клетками в развивающейся функциональной системе. После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как электрическая активность нейронов спинного мозга коррелирует с частотой спонтанных скручиваний хвоста.