Мембранный потенциал монокристалла монокристалла в живых эмбрионах данио

Общая цель этой процедуры заключается в изучении электрических свойств возбудимых клеток в неинвазивных физиологических условиях с использованием эмбрионов рыбок данио-рерио вместе с GEVI на основе FRET. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся биологии возбудимых клеток, таких как нейроны. Например, этот метод может быть использован для анализа роли возбудимости в патогенезе неврологических расстройств.

В этом подходе используются прозрачные эмбрионы рыбок данио, экспрессирующие генетически закодированные индикаторы напряжения на основе FRET. Этот подход позволяет измерять электрические свойства клеток in vivo неинвазивным способом. Таким образом, этот метод может дать представление о возбудимости спинномозговых нейронов у эмбрионов рыбок данио.

Он также может быть применен к другим системам in vitro или in-vivo, поддающимся визуализирующим исследованиям. Чтобы начать эту процедуру, приготовьте ПЦР-смесь для амплификации кодирующей последовательности биосенсора Mermaid. Нагрейте смесь для ПЦР в течение 15 секунд при температуре 95 градусов Цельсия.

Заправьте его на 15 секунд при температуре 50 градусов Цельсия и удлините на четыре минуты при температуре 72 градуса Цельсия, всего на 35 циклов. После этого гель очистите конкретный тупой продукт ПЦР с помощью коммерческого набора для очистки геля. Затем клонируйте фрагмент ДНК в тупой вектор pCMV-SC и линеаризуйте русалко-положительную плазмиду с помощью фермента рестрикции SmaI для вставки промотора HuC.

Настройте реакцию рестрикции в общем объеме 20 микролитров и инкубируйте реакцию при температуре 25 градусов Цельсия в течение одного часа. Впоследствии гелем очистите расваренную плазмиду с помощью коммерческого набора для очистки гелем. Затем с помощью ПЦР амплифицируют промотор HuC с помощью ДНК-полимеразы PFU и геномной ДНК рыбок данио в качестве матрицы.

Настройте смесь для ПЦР. После начального шага в течение двух минут при 95 градусах Цельсия нагрейте смесь для ПЦР в течение 15 секунд при 95 градусах Цельсия. Заправьте его на 15 секунд при температуре 50 градусов Цельсия и удлините на четыре минуты при температуре 72 градуса Цельсия, всего на 35 циклов.

Затем гелем очистите конкретным тупым продуктом ПЦР. Лигатировать эквимолярное количество очищенной pCMV-SC Mermaid и pHuC ДНК с использованием одного микролитра Т4-ДНК-лигазы и одного микролитра буфера Specific 10x в общем объеме 10 микролитров. После этого инкубируйте реакцию в течение 16 часов при четырех градусах Цельсия.

Трансформируйте аликвоту компетентных клеток с пятью микролитрами реакции лигирования. Выберите pHuC-положительные клоны с промотором, вставленным в правильной ориентации с помощью двойного разложения CEL1-EcoRV. Переложите клоны в 15-миллилитровые пробирки и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.

После этого извлеките плазмиду из клеток, запустите реакцию двойной рестрикции CEL1-EcoRV и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем запустите реакции на агарозный гель. При этой процедуре переложите оплодотворенную икру, полученную от дикого вида или взрослых рыбок данио-рерио sod1G93R, в 10-миллиметровую чашку Петри.

Промойте зародыши в холодной рыбной воде. Затем сразу же микровведите их в желток с 200 пикограммами плазмиды pHuC-Mermaid. Затем перенесите эмбрионы в чашку Петри и инкубируйте их в рыбьей воде при температуре 28 градусов Цельсия до тех пор, пока они не достигнут желаемой стадии развития для следующих анализов.

Для анализа спонтанного скручивания хвоста зародыши перенесли в круглую чашку Петри диаметром 90 мм, заполненную рыбьей водой, содержащей 0,2% ДМСО. И вручную дехорионировать их с помощью двух ювелирных щипцов с острыми кончиками или иглами. После этого инкубируйте эмбрионы в течение пяти минут при температуре 28 градусов Цельсия.

С помощью цифровой камеры, установленной на стереомикроскопе, можно обнаружить скручивание хвоста при комнатной температуре во время минутной видеозаписи. Далее получаем временные ряды с временным разрешением 30 кадров в секунду. Затем рассчитайте частоту спонтанных скручиваний хвоста, подсчитав количество изгибов в единицу времени.

Для оценки действия препарата рилузола перенесите эмбрионы в новую 90-миллиметровую чашку Петри, наполненную рыбьей водой, содержащей пять микромолярных рилузолов. Затем инкубируйте эмбрионы в течение пяти минут при температуре 28 градусов Цельсия, прежде чем записать одноминутное видео и провести поведенческий анализ. Теперь поместите от 20 до 24 эмбрионов HPF в однопроцентную агарозу с низкой температурой плавления в рыбью воду в 35-миллиметровую чашку со стеклянным дном при температуре 37 градусов Цельсия.

Расположите зародыши на бок и подождите, пока агароза застынет при комнатной температуре. Далее перенесите чашку для визуализации на столик конфокального микроскопа. Идентификация моторных нейронов, экспрессирующих биосенсор, путем возбуждения мономерного умикиноко-зеленого с помощью аргонового лазера 488 нанометров.

Затем установите его излучение в диапазоне от 495 до 525 нанометров и нажмите кнопку записи. Для измерения FRET возбуждайте mUKG, донора пары ладов, с помощью лазера с яркостью 488 нанометров. Одновременно с помощью двух фотоумножителей детектируют флуоресценцию, излучаемую донором, и флуоресценцию, излучаемую мономерным акцептором Кусибира-Оранж.

В начале эксперимента оптимизируйте усиление и смещение фотоумножителя, в котором регистрируется флуоресценция mUKG, и поддерживайте их постоянными на протяжении всего сеанса. Чтобы задать смещение, измените цвет изображения на значения интенсивности с помощью таблицы подстановки Q. При сканировании с выключенным лазером используйте ползунок смещения, чтобы интенсивность пикселей фона была немного выше нуля.

Используя ту же таблицу поиска, включите лазер. Во время сканирования используйте ползунок усиления, чтобы максимизировать соотношение сигнал/шум, стараясь избегать насыщенных пикселей. В окне получения программного обеспечения выберите режим сбора данных xyt и размер поля изображения 512 на 64 пикселя из выпадающего меню.

Затем установите запись изменений напряжения спинномозговых нейронов эмбриона так, чтобы получать одну плоскость XY каждые 30 миллисекунд в течение одной минуты. Для оценки влияния введения рилузола на деполяризацию мембран в том же нейроне получили новый набор данных через пять минут после добавления воды рыб, содержащей пять микромолярных рилузолов. В этом фильме были зафиксированы спонтанные скручивания, двигательные реакции, которые заключаются исключительно в сокращении всего тела, приводящем кончик хвоста к голове, на стадии от 20 до 24 hpf в обычной рыбной среде.

В этом фильме показаны спонтанные скручивания эмбриона после инкубации в пятимикромолярном рилузоле. Чтобы проверить, являются ли изменения электрической активности спинальных моторных нейронов причиной индуцированных рилузолом изменений частоты спонтанного скручивания, мембранный потенциал в спинномозговых нейронах эмбриона был изучен совершенно неинвазивным способом путем измерения отношения интенсивности флуоресценции донор-акцептор FRET биосенсора «Русалка». Идентифицированы первичные спинномозговые нейроны, экспрессирующие биосенсор, и зарегистрирована их базальная спонтанная деполяризационная активность.

Вместе со снижением частоты движений хвоста, введение рилузола снижало частоту спонтанных событий деполяризации. После освоения этот подход позволит исследователям изучать электрические свойства нейронных сетей интактных эмбрионов, что полностью сохраняет сложность взаимодействий между клетками в развивающейся функциональной системе. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как электрическая активность спинномозговых нейронов коррелирует с частотой спонтанных скручиваний хвоста.