Использование синтетической биологии инженеру живых клеток, которые взаимодействуют с программируемыми материалов

Общая цель этих процедур заключается в использовании синтетически спроектированной кишечной палочки для контроля и манипулирования программируемыми материальными поверхностями, сочетая стратегии генетической модификации и функционализации поверхностей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в таких областях, как молекулярная медицина и мониторинг окружающей среды. Используя генетически запрограммированные клетки для интерпретации локальной среды и соответствующей модификации функционализированного материала, мы предоставляем модульный инструмент для широкого спектра применений.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что живые клетки способны действовать как динамические датчики, способные считывать, обрабатывать и записывать условия вокруг них через функционализированные интерфейсы. После приготовления растворов и сбора обогащенной биотином надосадочной жидкости из биотин-продуцирующей E.coli в соответствии с текстовым протоколом к 20 микролитрам стрептавидина или раствора SA добавляют 1,4 мкл раствора SPDP. Оберните пробирку в алюминиевую фольгу и инкубируйте ее при комнатной температуре в течение полутора часов, чтобы сшивающий агент SPDP смог соединиться с SA через аминогруппу, образуя пиридилдитиоактивированный SA. После инкубации добавьте в пробирку 2,4 микролитра раствора DTT и инкубируйте образец при комнатной температуре в течение одного часа, чтобы обеспечить расщепление пиридин-2-тиона, приводящее к образованию сульфгидрил-активированного SA. Далее добавьте 7,5 микролитров раствора SCC в 72 микролитра раствора HRP, заверните его в алюминиевую фольгу и выдержите при комнатной температуре в течение полутора часов.

В результате получается активируемый малеимидом HRP, связанный аминогруппой. Смешайте 17 микролитров раствора биотина LC-LC с 200 микролитрами раствора БСА, заверните пробирку в фольгу и инкубируйте образец при комнатной температуре в течение полутора часов. Этот этап позволяет биотину конъюгироваться с BSA через амидную связь.

Перенесите раствор SA-SPDP, HRP-SMCC и раствор биотина, сопряженного с BSA, в отдельные центробежные концентраторы в спиновых трубках. Центрифугируйте SA-SPDP при 10 000 g до тех пор, пока объем пробирки не достигнет 100 микролитров или в течение 16 минут, затем заполните спиновую пробирку до 500 микролитров с помощью PBS-EDTA, прежде чем повторить отжим и добавление PBS-EDTA еще пять раз. После раскрутки раствора до 100 микролитров храните бульон при температуре четыре градуса Цельсия.

Для HRP SMCC центрифугируйте пробирки при 10 000 раз g до тех пор, пока объем не достигнет 25 микролитров или в течение 16 минут. Заполните спиновую трубку до 4500 микролитров с помощью PBS, прежде чем повторить отжим и добавить PBS еще пять раз. После раскрутки раствора до 100 микролитров храните бульон при температуре четыре градуса Цельсия.

Для биотина BSA центрифугируйте образец при 10 000 раз g до тех пор, пока объем не достигнет 100 микролитров или в течение 12 минут, затем заполните спиновую пробирку до 500 микролитров с помощью PBS. Повторив отжим и добавив PBS еще четыре раза, центрифугируйте пробирку до тех пор, пока объем не достигнет 100 микролитров или в течение 12 минут, затем добавьте в пробирку 100 микролитров PBS и храните бульон при четырех градусах Цельсия. Затем соедините 25 микролитров из 10 мг на миллилитр HRP с 25 микролитрами 10 мг на миллилитр раствора SA и храните пробирку при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи, затем приготовьте две аликвоты биотина BSA в PBS, добавив 10 микролитров биотина BSA к 490 микролитрам PBS.

Пипеткой внесите по 100 микролитров раствора в каждую лунку 96-луночного планшета. Заверните тарелку в фольгу и выдерживайте ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Далее добавьте в лунки 200 микролитров 05%Tween 80 и BPS.

Инкубируйте тарелку при комнатной температуре в течение двух минут, затем отсадите и сцедите жидкость. Повторив промывку три раза, добавьте по 200 микролитров 0,5%-ного обсадного раствора в каждую из лунок, затем выдержите пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа. После еще одного раунда промывки, как и раньше, смешайте 12 миллилитров 05% раствора оболочки с 7,5 микролитрами 05% Tween 80, затем используйте этот раствор для разбавления исходного раствора SA-HRP один к 10 000.

Пипеткой внесите 80 микролитров разведенного SA-HRP в каждую лунку 96-луночного планшета, затем добавьте по 20 микролитров приготовленного образца биотина в каждую лунку планшета. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Этот этап обеспечивает конкурентное связывание между свободным биотином и иммобилизованным биотином BSA для сайтов связывания SA-HRP.

Затем, промыв пластину три раза, как и раньше, приготовьте 20 миллилитровый раствор 50 миллимолярного ацетата натрия, 1% ТМБ и 3% перекиси водорода в соотношении 1000 к 10 к одному. Добавьте по 200 микролитров раствора в каждую лунку тарелки, заверните ее в фольгу и выдержите при комнатной температуре в течение 15 минут. Внесите пипеткой 50 микролитров двух молярных серной кислоты в каждую лунку, чтобы остановить реакцию, затем используйте планшетный ридер для измерения наружного диаметра 450.

После приготовления растворов по текстовому протоколу добавьте 7,5 микролитров биотина LC-LC к 72 микролитрам HRP. Заверните раствор в фольгу и инкубируйте образец при комнатной температуре в течение полутора часов с перемешиванием. На этом этапе биотин конъюгируется с HRP через амидную связь.

Перенесите раствор в центробежный концентратор внутри спиновой пробирки и центрифугируйте раствор в 10 000 раз g до тех пор, пока объем не достигнет 100 микролитров или в течение 12 минут, затем используйте PBS для наполнения спиновой пробирки до 500 микролитров и повторите центрифугирование и добавление буфера четыре раза. Затем добавьте 100 микролитров 0,17 микрограмма на миллилитр SA в PBS в каждую лунку 96-луночного планшета. Заверните тарелку в фольгу и выдержите ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа.

Чтобы промыть лунки пластины, наберите пипетку по 200 микролитров 05%Tween 80 в каждую лунку. Выдержите тарелку при комнатной температуре в течение двух минут и сцедите жидкость. Повторив промывку еще три раза, добавьте в лунки 200 микролитров 0,5%-ного обсадного раствора.

Выдержите пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, прежде чем промыть лунки три раза, как и раньше. Используя промытый и концентрированный раствор биотина HRP, приготовленный ранее, развести стоковый раствор биотина HRP один к 10 000, затем добавить 80 микролитров раствора в лунки 96 луночной пластины. Добавьте 20 микролитров подготовленного образца биотина в каждую лунку планшета и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, чтобы обеспечить конкурентное связывание между свободным биотином и биотином HRP для иммобилизованных сайтов связывания SA.

Промыв лунки три раза, как и раньше, приготовьте 20 миллилитровый раствор 50 миллимолярного ацетата натрия, 1% ТМВ и 3% перекиси водорода в соотношении 1000 к 10. Добавьте по 200 микролитров раствора в каждую лунку пластины, накройте ее фольгой и выдержите при комнатной температуре в течение 15 минут, затем добавьте в каждую лунку по 50 микролитров двумолярной серной кислоты, чтобы остановить реакцию. Наконец, используйте считыватель пластин для измерения наружного диаметра 450.

Сконструированные индуцируемые клетки дикого типа E.coli MG1655 выращивали и контролировали в минимальной и минимальной среде с добавлением DTB и/или IPTG. На этих графиках показано показание наружного диаметра 600, измеряемое каждые пять минут в течение 24 часов. В этом эксперименте флуоресцентный белок mCherry был использован вместо гена bioB, чтобы профиль индукции можно было измерить, когда сконструированные клетки индуцировались с помощью IPTG.

Эти результаты демонстрируют эффективность индуцируемой генной сети. Здесь представлены оптические сигналы на OD 450 в ответ на изменение концентраций биотина как для непрямой, так и для прямой функционализованной схемы. В этом эксперименте продукты индуцированных инженерных клеток были использованы для химической модификации функционализированной поверхности.

Различные концентрации биотина представлены в том виде, в каком они были измерены с помощью схемы косвенного контроля функционализованной поверхности для клеток дикого типа, неиндуцированных клеток, содержащих плазмиду pKE1-lacI-bioB, и индуцированных клеток, содержащих плазмиду pKE1-lacI-bioB. После освоения клетки могут быть генетически модифицированы за два дня, в то время как методы прямой и косвенной функционализации поверхности могут быть выполнены за пять часов, если они выполнены правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что необходимо избегать загрязнения бактериальной клеточной культуры и покрывать поверхности во время функционализации, чтобы избежать фотообесцвечивания.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как функционализировать поверхности как для прямой, так и для косвенной схем управления. Не забывайте, что работа с бромидом этидии может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток.