Идентификация растений ледово-связывающих белков путем оценки льда рекристаллизации ингибирования и выделение с помощью льда-аффинной очистки

Общая цель этого протокола заключается в выявлении новых белков, связывающих лед или IBP, из растений путем тестирования на активность связывания льда и выделения нативных пептидов с помощью аффинной очистки льдом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области устойчивости растений к замораживанию, в частности, к белкам, связывающим лед. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет выделять из нативных экстрактов белки, связывающие лед, без применения сложных методов очистки.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку конфигурацию устройства может быть трудно концептуализировать. Начните этот протокол с настройки splat-аппарата, как описано в текстовом протоколе. Чтобы вызвать экспрессию связывающих лед белков, или ИБП, у морозоустойчивых трав или других морозоустойчивых видов растений, растения акклиматизируются в холоде до одной недели при температуре четыре градуса Цельсия в условиях низкой освещенности.

Получите примерно 0,1 грамма ткани листа, разрезав у основания стебля, а затем поместив в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Немедленно заморозьте образец в жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования. Чтобы лизировать клетки, измельчите образец ткани в мелкий порошок с помощью ступки и смочите под жидким азотом.

Следите за тем, чтобы жидкий азот не испарялся в процессе гомогенизации. Сразу же поместите измельченные образцы на лед и дайте жидкому азоту полностью испариться. Затем добавьте один миллилитр буфера для экстракции нативного белка и пипетку для перемешивания.

Осторожно встряхните образцы на ночь при температуре четыре градуса Цельсия и выполните оставшиеся шаги при той же температуре. На следующий день удалите клеточный мусор, центрифугируя образцы при температуре примерно 1600 G в течение пяти минут. Оставьте растворимую фракцию и центрифугуйте еще на пять минут, если клеточный мусор сохраняется.

Осветленные образцы можно хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия до использования. Налейте 100 миллилитров гексана во внешнюю камеру, установленную поляризованной пленкой, и добавьте пять-шесть гранул высыхания, чтобы предотвратить скопление влаги на предметных стеклах. Затем добавьте небольшое количество вакуумной смазки на пластину, закрывающую ванну, и покрутите, чтобы обеспечить плотное прилегание и предотвратить испарение гексана.

За 40 минут до начала эксперимента поместите охлаждающий блок в полистирольную коробку прямо под пластиковой трубкой и полностью накройте ее сухим льдом. Перед началом анализа убедитесь, что трубка выровнена. Затем снимите сухой лед с верхней части холодного блока.

Сначала протестируйте эту процедуру с водой, чтобы определить, куда на охлаждающем блоке упадет образец. Окуните одноразовый наконечник, прикрепленный к автоматической пипетке, в погружное масло, что позволит образцу падать, а не прилипать к внешней стороне пипетки. Используйте бумажное полотенце, чтобы удалить излишки масла.

Затем отсасывайте 10 микролитров воды. Перед выпуском воды поместите пипетку прямо на пластиковую трубку. Отчетливый звук брызг должен быть слышен, когда вода ударяется о охлаждающий блок, создавая монослой кристаллов льда.

Затем поместите стеклянную крышку микроскопа на отметку капли, которая была определена водой. Непосредственно перед началом анализа включите источник света и соскребите весь лед, который образовался на дне стеклянной камеры. Затем проведите анализ на брызги с образцом, как это было сделано для воды, выпустив 10 микролитров образца на предметное стекло для создания монослоя кристаллов льда.

Быстро и аккуратно снимите предметное стекло микроскопа с холодного блока с помощью пинцета и поместите в гексановую ванночку поверх поляризационной пленки. Глядя под микроскоп, поместите предметное стекло микроскопа в поле зрения и отрегулируйте линзу объектива так, чтобы кроссполяризация позволяла визуализировать высококонтрастные кристаллы льда. Прикрепите камеру к микроскопу и отрегулируйте настройки на макро, чтобы обеспечить четкую визуализацию кристаллов льда и захват изображения.

Повторите эти действия для всех образцов. Обычно в гексановую камеру помещают до шести предметных стекол с разным образцом. Закончив, выключите источник света.

Затем поместите пластиковую пластину над гексановой ванной, обеспечив плотное прилегание, и дайте кристаллам льда отжечь в течение ночи. После инкубации сделайте снимки ледяных пленок, как и раньше. После холодной акклиматизации тканей растения, как и раньше, соберите примерно от 100 до 150 граммов измельченной биомассы в 20-миллилитровые пробирки.

Немедленно заморозьте образцы и держите их при температуре минус 80 градусов по Цельсию перед использованием. Подготовьте образец, как и раньше, используя соотношение один к одному для повторного суспензирования ткани листа. Используйте дополнительные таблетки ингибитора протеазы, чтобы избежать деградации АДП эндогенными протеазами.

Чтобы удалить клеточный мусор, просейте лизат через два слоя марли три раза. Измельчите мусор методом центрифугирования при 30 000 умноженных на G в течение 40 минут при четырех градусах Цельсия. Затем увеличьте объем образца до 120 миллилитров с помощью буфера для экстракции нативного белка и немедленно используйте лизад для очистки льдом по сродству льда, чтобы избежать потери активности связывания льда.

Охладив ледяной палец до минус 0,5 градуса Цельсия, впоследствии погрузите его в 50-миллилитровую трубку, содержащую холодную дистиллированную воду. Добавьте несколько ледяных чипсов, чтобы облегчить зарождение льда и позволить тонкому слою льда образоваться на пальце. Этот процесс обычно занимает от 20 до 30 минут.

Поместите образец в стеклянный стакан объемом 150 миллилитров, содержащий небольшую магнитную мешалку, которая помещена в контейнер из полистирола в верхней части магнитной мешалки. Убедитесь, что ледяной палец отцентрирован и опущен как минимум на полпути в жидкий образец. Затем укупорьте емкость.

Дайте программе поработать примерно два дня, проверяя каждые 24 часа. Как только 50% образца будет заморожено, остановите программу. Включение ИБП в полусферу льда приведет к травлению льдом.

Чтобы удалить ледяную полусферу, нагрейте зонд до четырех градусов по Цельсию. Затем промойте полусферу дистиллированной водой, чтобы удалить несвязанный белок, и разморозьте при четырех градусах Цельсия. Если ледяное полушарие все еще содержит пигмент, или для повышения очистки образца повторите этапы очистки два-три раза.

Здесь показаны экстракты, собранные из буферного контроля, в котором отсутствуют IBP, и экстракты дикого типа Arabidopsis thaliana, которые не содержат IBP. Через 18 часов буферный контроль и экстракты A.thaliana не могут ограничивать рост кристаллов льда. Напротив, мелкие кристаллы льда, наблюдаемые с экстрактами трансгенных A.thaliana, экспрессирующих IBP из акклиматизированного к холоду Lolium perenne, существенно ограничивают рост кристаллов льда.

После первого раунда очистки высокая степень травления льда на поверхности полушария указывает на то, что ИБП адсорбировались на льду и изменили рост кристаллов льда. Чтобы удалить дополнительные растворенные вещества, пигменты и загрязняющие белки, был использован второй раунд аффинности льда, в результате чего полушарие льда стало более чистым. После этой процедуры можно оценить формирование льда и термический гистерезис с помощью нанолитра для дальнейшей характеристики белков, связывающих лед.

Кроме того, выделенные фракции могут быть отправлены на масс-спектрометрию с целью идентификации пептидных последовательностей.