Идентификация эритромиелоидных прародителей и их потомство в мышечном эмбрионе методом проточной цитометрии

Общая цель данного эксперимента заключается в характеристике гемопоэтических предшественников желточного мешка и их потомства in vivo с использованием системы картирования судеб клеток у мышей, индуцируемой тамоксифеном, и проточной цитометрии. Это может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, касающиеся развития и дифференцировки гемопоэтических предшественников, которые отличаются от гемопоэтических стволовых клеток. Основным преимуществом данной методики является возможность мониторинга гемопоэтических предшественников, меченных в ограниченный временной интервал, и их потомства, например резидентных макрофагов, в процессе развития и во взрослом состоянии.

Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями из-за малого количества клеток в эмбриональной ткани и большого объема одновременно обрабатываемых образцов. Чтобы начать эксперимент, сначала перенесите препарированные рога матки мыши в чашку Петри диаметром 10 миллиметров, заполненную примерно 30 миллилитрами ледяного PBS. Сразу после этого захватите мышечные слои матки у шейного конца рога и аккуратно проведите тонкими ножницами между мышечным слоем и децидуальной тканью, чтобы извлечь эмбрионы.

Затем с помощью тонкого пинцета удалите мембрану Райхерта и извлеките плаценту. Осторожно препарируйте желточный мешок и перенесите его в 24-луночный планшет для культивирования тканей, заполненный 0,5 мл раствора для переваривания. После перерезания пупочных и вителлиновых сосудов немедленно перенесите эмбрион в 12-луночный планшет для культивирования тканей, заполненный 2 мл ледяного 10 мМ EDTA.

После отделения головы эмбриона с помощью острых тонких ножниц выдержите тело и голову на льду от 10 до 15 минут, затем извлеките эмбрион и соберите кровь, содержащую EDTA. Далее удалите амнион, окружающий эмбрион. После этого удалите задние конечности и посторонние придатки из эмбриона.

С помощью тонкого пинцета вскройте грудную клетку. Затем захватите переднюю часть сердца и осторожно потяните ткани, одновременно извлекая внутренние органы из тела вторым пинцетом. Под диссекционным микроскопом отделите печень плода от сердца и кишечника.

Затем перенесите орган в 24-луночный планшет, заполненный 0,5 мл раствора для переваривания. Для идентификации печени плода критически важно определить ее анатомическую связь с сердечно-сосудистой системой. Печень плода все еще находится на этой стадии развития, и чем моложе эмбрионы, тем сложнее может быть процесс препарирования.

Для приготовления первичных клеточных суспензий инкубируйте собранные органы в растворе для дигестии при 37 °C в течение 30 минут. Перенесите ткань в ферментативном растворе в стрейнер с размером пор 10 µm, установленный на одну лунку шестилуночного планшета для культивирования тканей, заполненную 1 mL FACS-буфера. Используйте черный резиновый поршень от шприца объемом 2 mm для диссоциации ткани путем осторожного разминания до получения суспензии единичных клеток.

Затем аспирируйте клеточную суспензию с помощью пипетки Пастера и перенесите ее в пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте суспензию при 320 ×g при температуре 4 °C в течение 7 минут. После центрифугирования аспирируйте и удалите супернатант.

Затем приготовьте свежий блокирующий буфер Fc и ресуспендируйте осадок в 60 µL. После этого перенесите 50 µL суспензии единичных клеток в лунку 96-луночного планшета с круглым дном. Инкубируйте планшет на льду не менее 15 минут.

Затем перенесите оставшиеся 10 µL суспензии в полистирольную пробирку для FACS объемом 5 мл, чтобы получить пул образцов, полученных из различных тканей. Перенесите по 50 µL этого пула в 96-луночный планшет для подготовки FMO-контролей для каждого флуорохрома. Чтобы приступить к окрашиванию поверхностных антигенов, используйте набор из шести антител с флуорохромами для приготовления раствора антител и FACS-буфера.

Затем приготовьте шесть растворов антител и FACS-буфер, используемые для окрашивания FMO-контроля. После этого добавьте по 50 µL растворов антител в образцы в 96-луночном планшете. Перемешайте образцы путем осторожного двойного пипетирования, а затем инкубируйте планшет на льду в течение 30 минут.

Центрифугируйте 96-луночный планшет при 320 ×g при температуре 4 °C в течение 7 минут и удалите супернатант. Промойте клетки в 200 µL FACS-буфера и центрифугируйте планшет еще раз. Следует соблюдать особую осторожность при удалении супернатанта путем переворачивания планшета.

96-луночный планшет необходимо перевернуть одним резким движением кисти, чтобы избежать отрыва клеток. Наконец, используя процеживатель с размером пор 70 мкм, отфильтруйте образцы тканей и контрольные образцы в 6-миллиметровые полистирольные пробирки. Теперь можно проводить анализ методом проточной цитометрии.

Популяция живых одиночных неэритроцитарных клеток была проанализирована на экспрессию маркера клеток-предшественников KIT и маркера гемопоэтических клеток CD45. В целевой популяции было выделено три различные субпопуляции клеток: KIT-положительные CD45-отрицательные, KIT-положительные с низким уровнем экспрессии CD45 и KIT-отрицательные CD45-положительные.

Среди KIT-положительных предшественников из желточного мешка как CD45-отрицательная, так и CD45-низкая популяции клеток содержали AA4.1-положительные клетки, экспрессирующие желтый флуоресцентный белок (YFP), что указывает на то, что незрелые KIT-положительные предшественники сначала экспрессируют AA4.1 независимо от экспрессии CD45. AA4.1-положительные YFP-положительные клетки в печени и головном мозге были обнаружены только в популяции KIT-положительных CD45-низких предшественников и, скорее всего, соответствуют циркулирующим предшественникам, происходящим от предшественников желточного мешка. Макрофаги были обнаружены в KIT-отрицательной CD45-положительной популяции и были идентифицированы как F4/80-яркие CD11b-положительные клетки.

Макрофаги в желточном мешке, печени и головном мозге были эффективно помечены путем однократного введения 4-гидрокситамоксифена, что может указывать на их происхождение из ENP. При должном исполнении процедура изоляции и окрашивания клеток, после освоения метода, может быть выполнена за три-четыре часа. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости постоянно хранить образцы на льду сразу после их сбора.

Свежие буферы для FACS следует готовить ежедневно и фильтровать. После выполнения данной процедуры для получения ответов на дополнительные вопросы о потенциале дедифференцировки и протофазы постмаркированных клеток можно использовать другие штаммы с репортерами mash или flux, такие как линии Rosa MTMG или Rosa confetti.