Экологические обследования Aeromonas hydrophila, микобактерии spp. и Pseudocapillaria tomentosa в системах данио рерио

Общая цель этого метода отбора проб заключается в сокращении количества рыбы, используемой для мониторинга здоровья, и в оптимизации оборота, стоимости и чувствительности обнаружения патогенов, в том числе при скрининге импортируемых товаров в карантине. Этот метод помогает определить состояние здоровья колоний-заповедников. Этот метод является полезным инструментом при чтении или оценке эффективности лечения.

Одним из основных преимуществ этого метода является скрининг и сортировка импортируемых товаров в условиях карантина. Это укрепляет план биобезопасности водного объекта. Чтобы начать составление протокола, установите чистый восьмилитровый бак из рециркуляционной системы.

Наполните бак примерно восемью литрами воды, полученной из отстойников. Добавьте две керамические бусины или губчатые кубики биосреды из систем для просеивания. Далее добавьте одну для выполнения Danio rerio на литр, используя дикий тип рыбы доминирующего генетического фона на объекте, например А Б. Выберите не менее шести рыб.

Кормите рыб один раз в день. Варьируйте рацион, чтобы убедиться, что дозорные подвергаются воздействию всех диет, используемых в питомнике для рыбок данио. Чтобы провести подмену воды, перенесите дозорных в биосреде во временный резервуар.

Полностью опустошите сторожевой бак и очистите его. Наполните контрольный бак только водой из отстойника и установите сторожевые и бионосители обратно. После того, как часовые подвергались воздействию отстойной воды в течение четырех месяцев, усыпьте рыбу утвержденным методом, таким как погружение в раствор передозировки 2-феноксиэтанола.

Чтобы подтвердить смерть, подождите десять минут после прекращения движения оперкулума. Захватите труп щипцами и полностью заморозьте его при температуре минус 80 градусов Цельсия в определенном контейнере. Подготовьте стерильный сухой тампон с пластиковым стержнем и наденьте перчатки.

Найдите поверхность для тампона. Выберите поверхность отстойника с низким расходом, стенку отстойника у поверхности воды, и удалите все предметы, препятствующие легкому доступу к поверхности. Затем обнажите тампон, сняв внешнюю упаковку, и выставьте стерильный ватный кончик на воздух.

Промокните стенку отстойника на пять-10 сантиметров, чтобы впитать воду и биопленку на уровне поверхности воды в отстойнике. Затем вложите тампон обратно в ножны или разломайте наконечник в стерильную центрифужную пробирку. Пометьте образец и отправьте его на ПЦР-тестирование или заморозьте при отрицательных 80 градусах Цельсия.

Для проведения анализа осадка с помощью микроскопии используйте шприц объемом 60 миллилитров для отсасывания осадка на дне отстойника. Разделите образец на пробирки объемом 15 миллилитров. Закрутите крышки и пробирки промаркируйте.

Центрифугируйте пробирки объемом 15 миллилитров при давлении от 175 до 250 раз сильнее силы тяжести в течение десяти минут в центрифуге с качающимися ведрами. Сцедите трубки. После декантации сохраните осадок.

Далее приготовьте насыщенный сахаром раствор, смешав 227 грамм сахарного песка и 177 миллилитров горячей воды с помощью магнитной мешалки. Заполните пробирки наполовину раствором, насыщенным сахаром. Закрутите крышки и тщательно перемешайте осадок с раствором.

Поместите пробирки в качающиеся ведра центрифуги и заполните их доверху раствором, насыщенным сахаром. Аккуратно установите по одному защитному стеклу на верхнюю часть каждой трубки так, чтобы он соприкасался с раствором, насыщенным сахаром. Обратите внимание, что четыре пробирки на каждый образец объемом 60 миллилитров находятся на случай, если во время центрифугирования упадет и разобьется стекло крышки.

Как только вращение завершится, поднимите покровное стекло и установите его на предметное стекло, затем пометьте предметное стекло карандашом или маркером. В случае, если произойдет слишком много поломок покровного стекла, заполните большую часть пробирки раствором, насыщенным сахаром, и центрифугируйте пробирку. Наполните доверху раствором, насыщенным сахаром, затем аккуратно установите крышку стекла и подождите 30 минут.

Ищите яйца псевдокапилляров войлочных с помощью микроскопа. Определите биполярные вилки при увеличении 400X. Для скрининга импортированных животных в карантине на икру P.tomentosa поместите самца и самку Danio rerio в аквариум и добавьте в него нерестовый лоток, но используйте его здесь для сбора фекалий.

Через неделю снимите устройство для размножения и соберите собранный осадок в устройстве для разведения, как описано ранее. Отсадите ил на дно резервуара или отстойника с помощью шприца объемом 60 миллилитров и перенесите образец в пробирку объемом 60 миллилитров. Закройте трубку завинчивающейся крышкой и наклейте на нее этикетку.

Утилизируйте шприц. Встряхните 60-миллилитровую трубку и переложите 15 миллилитров в 15-миллилитровую трубку. Закройте трубку завинчивающейся крышкой и наклейте на нее этикетку.

Центрифугируйте пробирку объемом 15 миллилитров при давлении от 175 до 250 раз сильнее силы тяжести в течение десяти минут в центрифуге с качающимися ведрами. Сцедите трубки и сохраните осадок в трубке. Обнажите тампон, сняв внешнюю упаковку, и подставьте стерильный ватный кончик на воздух.

Смываем осадок в пробирке в течение 15 секунд. Оберните тампон обратно или разбейте кончик в стерильную центрифужную пробирку. Пометьте образец.

Заморозьте при отрицательной температуре 80 градусов по Цельсию и отправьте на ПЦР-тестирование. Используя метод мазка из 115 протестированных рыб, Mycobaterium chelonae был обнаружен в пяти процентах образцов, а Mycobaterium haemophilum был обнаружен в трех процентах образцов и был единственным идентифицированным патогенным видом. Из тех же систем 49 мазков из отстойника выявили присутствие пяти видов Mycobaterial.

Отношения шансов показывают, что метод мазка с поверхности является ценной альтернативой единственному использованию дозорных для скрининга объекта данио-рерио на Mycobacterium. Образцы окружающей среды также были использованы для скрининга Aeromonas hydrophila, которые были обнаружены в рыбе, иле и поверхностных пробах, что подтверждает способность предложенных методов скрининга биотопа рыб. Mycobacterium chelonae и Mycobacterium fortuitum чаще обнаруживаются методом ПЦР в мазках из поверхностного отстойника, чем в образце рыбы.

После освоения отбора проб требуется всего несколько минут, а обнаружение яиц псевдокапилляров войлочно-войлочных может быть сделано за час. Этот метод делает скрининг окружающей среды ключевой частью программы рутинного мониторинга здоровья. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области патологии рыб, такие как связь между биопленкой бактерий и бактериальной инфекцией.