Использование первичных культур нейросферы для изучения первичных ресничек

Общая цель этой процедуры заключается в использовании нейросферных методов культивирования первичных нейральных стволовых и прогениторных клеток для изучения первичного биогенеза и трафика ресниумов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области первичных ресничек, такие как биогенез ресничек и транспортировка молекул ресничек к первичным ресничкам. В первичных нейральных стволовых клетках, нейральных предшественниках и нейронах.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы можем использовать первичные клеточные критерии нейральных стволовых клеток, нейронных предшественников и нейронов для анализа биогенеза и ресничных путей в контексте первичной реснички. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что культивирование нейральных стволовых клеток технически сложно для новичков. Мы покажем, что демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку рассечение бокового желудочка и такие этапы, как культивирование нейросфер и количественная оценка первичных ресничек, легко изучаются, наблюдая за критическими этапами.

Начните эту процедуру с субвентрикулярной зоны бокового вентрика, рассеченного у взрослой мыши методом диссекции всего монта. Поместите салфетку, содержащую СВЗ, в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте 500 микролитров 0,05%Trypsin-EDTA в PBS и выдерживайте 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане.

После инкубации добавьте 500 микролитров стопорной среды и аккуратно пипетируйте от 20 до 30 раз, используя наконечник объемом 1 миллилитров. Избегайте образования пузырьков воздуха во время пипетирования. После этого вращайте ячейки в 500 раз G в течение восьми минут.

Выбросьте надосадочную жидкость, затем добавьте 1 миллилитр PBS и повторно суспендируйте клетки, аккуратно пятикратно пипетируя наконечником объемом 1 миллилитров. Центрифугируйте при 500 умноженных на G в течение восьми минут. Затем аспирируйте среду с помощью наконечника объемом 1 миллилитр и добавьте 1 миллилитр базальной среды.

После подсчета клеток поместите клетки из одного СВЗ в 10-сантиметровую чашку с 10 миллилитрами среды NSC и культивируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Через пять-семь дней можно наблюдать нейросферы. Чтобы проанализировать клетки в прикрепленных нейросферах с помощью иммуноокрашивания, перенесите 1 миллилитр среды, содержащей несколько нейросфер, в пробирку объемом 1,5 мл и вращайте вниз с температурой 500 G в течение восьми минут.

После удаления среды зафиксируйте сферы 4%-ным параформальдегидом на 15 минут. После удаления параформальдегида инкубируйте сферы с 30% сахарозой, в течение ночи. А затем снова центрифугировать.

Постирайте с помощью PBS. Затем, после центрифугирования, как и раньше, удалите надосадочную жидкость. Затем установите пипетку с отрезанным наконечником на 1 миллилитр и нанесите на нейросферы 500 микролитров раствора ОКТ.

Переложите раствор ОКТ, содержащий нейросферы, в одноразовую пластиковую форму для замораживания. Затем заморозьте форму на сухом льду не менее чем на 15 минут. Разрежьте срезы с помощью криостата.

Для визуализации стволовых клеток в нейросфере проводят иммуноокрашивание против маркера стволовых клеток Нестин. Чтобы визуализировать первичные реснички в нейросфере, проведите иммуноокрашивание против ARL13B. Начинайте этот эксперимент через один-два дня после посева адгезивных диссоциированных нейральных стволовых клеток на покровные листы, покрытые поли-L-лизином и ламинином.

В опытных скважинах среду сменить на голодающую, а в контрольных скважинах – на свежую среду НБК. Инкубируйте еще 24 часа. На следующий день зафиксируйте клетки 4%-ным параформальдегидом в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре.

После фиксации промойте PBS дважды по пять минут каждый, при комнатной температуре. А затем проводят иммунофлуоресценцию по стандартным протоколам. Закрепите защитные планки с помощью монтажного раствора.

Затем высушите предметное стекло в течение ночи при комнатной температуре в темноте. На следующий день получите изображения на составном микроскопе с необходимым увеличением. Камерой микроскопа и объективами следует управлять с помощью прилагаемого программного обеспечения.

Сделайте достаточное количество z-срезов с интервалом от 0,5 до 0,8 микрона. Для количественного анализа ресничной локализации в адгезивных клетках выберите от трех до восьми последовательных полей с конфлюентными клетками по каналу DAPI. Получайте стопки изображений из каждого поля.

Количественное определение количества первичных ресничек с помощью ImageJ. Откройте диалоговое окно «Анализ подключаемых модулей» и выберите инструмент «Счетчик клеток», чтобы подсчитать клетки с положительным результатом GPCR ресничек. Используйте одинаковые параметры интенсивности и контрастности изображений для всех изображений из одного эксперимента для подсчета и экспорта.

Через 24 часа после культивирования диссоциированные клетки в среде НСК или в среде голодания фиксировали и иммуноокрашивали против GPR161, показанного зеленым цветом, ARL13B, который отображается красным, и ДНК, показанной синим. GPR161-положительные реснички наблюдаются в контрольных клетках слева и в клетках голодания справа. Как видно на этих увеличенных видах.

Белые стрелки и стрелки указывают на положительный и отрицательный GPR161 положительные и отрицательные реснички соответственно. На этом изображении показано количественное определение положительных реснитчатых клеток ARL13B. Количественная оценка выполняется с двух полей зрения, каждое из которых является одним из двух технических повторов одного эксперимента.

Процент ARL13B положительных реснитчатых клеток увеличивается при голодании. На этом изображении показана количественная оценка локализации GPR161 в положительных ресничках ARL13B в контрольных и голодных клетках. Процент GPR161, локализующегося в положительных ресничках ARL13B, также увеличивается при голодании.

После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за два часа, если она выполнена правильно. После этой процедуры может быть выполнен другой метод культивирования клеток, полученных из первичной опухоли, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как роль ресничек в опухолевом генезе. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области первичных ресничек к изучению биогенеза ресничек и трафика в первичных нейросферных системах.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как анализировать первичные реснички в нейральных стволовых клетках, нейронных предшественниках и нейронах, полученных из культур на основе нейросферы.